La base bioquímica de la coloració taronja en el gat domèstic

Genètica: Hiroyuki Sasaki és professor de genètica de la Universitat de Kyushu. El seu grup de recerca treballa en epigenètica i imprompta genètica. Dins d’aquest grup, Hidehiro Toh ha liderat una recerca sobre el mecanisme molecular que hi ha al darrera de la coloració taronja d’alguns gats domèstics oferint una resposta en un article a Current Biology. La genètica clàssica havia determinat que aquesta coloració seguia una herència mendeliana vinculada al sexe, de manera que enuncià l’existència d’un locus O (orange). Aquest locus O provocaria la supressió de la pigmentació negra-bruna per una de taronja. Això es dedueix dels patrons de coloració carei i calico, on hi ha una alternança de clapes negres-brunes i taronges. Aquesta alternança en femelles seria mitjançada per la inactivació aleatòria d’un dels dos cromosomes X en els diferents llinatges cel·lulars que participen en la pigmentació del pèl. Tot i amb tot, fins ara no s’havia identificat el gen responsable. Toh et al. reporten que han trobat associada d’una manera estreta i exclusiva amb la coloració taronja una deleció de 5100 parells de nucleòtids dins d’un intró del gen ARHGAP36 del cromosoma X. Aquest gen codifica una proteïna activadora de GTPasa Rho. En la regió de la deleció trobem un possible element regulador altament conservat, sense el qual hi hauria una alteració de l’expressió del gen ARHGAP36. L’expressió d’aquest gen en teixits cutanis felins es vincula a la repressió de molts gens de melanogènesi, la qual cosa afavoriria un desplaçament pigmentari de l’eumelanina ‘negra’ a la feomelanina ‘rossa’. Toh et al. han trobat en models cel·lulars humans i murins que aquest gen pateix la inactivació del cromosoma X per un mecanisme de metilació d’illes CpG. Com que la deleció que han trobat és ben difosa entre gats domèstics amb coloració taronja, dedueixen que un origen genètic comú d’aquest fenotip.

En les gates calico hi ha una combinació de color negre, taronja i blanc. Toh et al. han trobat que la base molecular de la coloració taronja obeeix a una deleció en el gen ARHGAP36 del cromosoma X. Aquesta deleció altera l’expressió d’aquest gen, la qual cosa provoca un desplaçament pigmentari. El gen ARHGAP36, com la majoria de gens del cromosoma X, és subjecte d’una inactivació aleatòria en les femelles. El fet que aquesta deleció estigui ben distribuïda entre els gats indicaria un origen únic d’aquest fenotip.

La coloració del gat domèstic

El gat domèstic (Felis silvestris catus) és valorat com a animal de companyia, en el control d’animàlies i en investigació biomèdica. Hom assum que el seu origen remuntaria uns 10.000 anys a partir del gat salvatge líbic (Felis silvestris lybica).

La coloració és el tret més pregon de la variació fenotípica del gat domèstic. Els patrons de coloració del pèl obeirien a interaccions entre múltiples loci genètics. La genètica clàssica s’interessà aviat en els patrons d’herència d’aquesta coloració. De fet, la coloració taronja del gat domèstic posà les bases de la identificació d’un mecanisme d’herència lligat al sexe, el que avui es coneix com a herència vinculada al cromosoma X.

Així doncs resultà definit el locus O del gat domèstic. Aquest locus controlaria el mecanisme que provoca la supressió de la pigmentació negra-bruna pròpia de l’eumelanina per la pigmentació taronja-rossa de la feomelanina. Els patrons carei i calico, gairebé exclusivament femenines, contenen aquesta coloració taronja. En la patró carei hi ha alternança de clapes taronges i negres-brunes. En el patró calico hi ha alternança de clapes més extenses de colors taronja, negre-bru i blanc.

Aquestes alternances de color obeirien al fenomen de la inactivació del cromosoma X, que és un mecanisme epigenètic que equalitza la dosi gènica dels gens del cromosoma X en femelles (XX) i mascles (XY). Fou Mary Lyon qui suggerí aquest mecanisme, és a dir que un dels dos cromosomes X de l’embrió femení és seleccionat aleatòriament i inactivat en cadascuna de les cèl·lules embrionàries. Així en l’embrió femení es formen llinatges cel·lulars que tenen inactivat permanentment un cromosoma X o l’altre. Quan una femella té en un cromosoma X l’al·lel salvatge del locus O i en l’altre cromosoma X l’al·lel taronja, es forma un patró en mosaic. És per aquesta raó que els patrons carei i calico són propis de femelles heterozigòtiques per al locus O. No obstant, hi ha mascles carei i calico, cosa que s’explicaria per aneuploïdies del cromosoma sexual com la conformació XXY, situacions de quimerisme o mosaïcisme o mutacions somàtiques.

Per tal de conèixer quin és el gen que hi ha al darrere del locus O s’han realitzat en el passat estudis de mapatge genètic basats en marcadors de microsatèl·lits. Les dades indiquen que el locus O es trobaria en una regió de 9,7 Mb del cromosoma X. Les anàlisis d’haplotips d’aquests microsatèl·lits suggereixen orígens múltiples de l’al·lel O. L’ús d’un arrai d’ADN ha identificat un haplotip de 1,5 Mb associat a la coloració taronja. En aquest bloc hi ha uns 12 gens que podrien ser-hi al darrere, però de cap d’ells es coneix que pugui regular la síntesi de melanina.

Toh et al. han utilitzat en aquest estudi una altra aproximació basada en la comparació de seqüències genòmiques de gats amb color taronja (careis, calicos i altres) i gats sense color taronja. Amb aquesta comparació han identificat una deleció de 5,1 kb en un dels gens codificadors de proteïna de l’haplotip esmentat de 1,5 Mb que és associada estretament i exclusivament amb la coloració taronja. També han vist que aquest gen pateix la inactivació de cromosoma X en diverses espècies de mamífers.

Una recerca sistemàtica per seqüenciació genòmica

Toh et al. han seqüenciat mostres d’ADN de 18 gats, entre els quals hi havia 8 gats calico, 1 gat carei, 1 gat amb coloració blanca i taronja, i 8 gats sense coloració taronja. Les lectures obtingudes foren mapades en el genoma felí AnAms1.0, corresponent a un tabby platejat americà de pèl curt.

En la regió de l’haplotip de 1,5 Mb associada al locus O, Toh et al. compten 13 possibles gens codificadors de proteïna. En la comparació amb AnAms1.0, Toh et al. han trobat en els 10 gats amb color taronja un total de 2569 petites variants genètiques entre polimorfismes mononucleotídics i petites insercions/delecions. En els 8 gats sense color taronja hi han trobat 2073 variants.

Pel que fa a a les 2569 variants dels gats de pèl taronja, n’hi ha 594 que no són compartides amb cap dels 8 gats sense pèl taronja.

Dins del marc de la 99 Lives Cat Genome Sequencing Initiative, hi ha dades genòmiques de 7 gats sense pèl taronja, en els quals hi ha 901 petites variants respecte de AnAms1.0. En creuar el llistat de 594 variants amb aquestes 901, resulten 450 petites variants que serien exclusives de gats amb pèl taronja. És significatiu que cap d’aquestes 450 variants comporti una alteració de pauta de lectura, un canvi aminoacídic o la introducció d’un codó stop en algun dels exons dels gens codificadors de proteïnes.

Toh et al. passaren doncs a analitzar la seqüència de la regió de 1,5 Mb, identificant-hi una deleció de 5,1 kb que era present únicament en el grup de gats taronges. Aquesta deleció se situa en el primer intró del gen ARHGAP36. És present en tots i cadascun dels 10 gats de pèl taronja de l’estudi. No és present en cap dels 8 gats sense pèl taronja de l’estudi.

En el cas del 8 gats calico i el gat carei de l’estudi, l’esmentada deleció es troba en heterozigosi. Això explicaria perquè en aquests gats el pèl taronja apareix únicament en clapes.

Pel que fa a nou gats d’altres estudis, la deleció únicament és present en un gat calico, de nom Cali, i en el seu pare, de nom Orion. Cali tenia la deleció en heterozigosi.

En estudis previs s’havien identificat com a polimorfisme mononucleotídic més estretament associats a la coloració taronja aquell que correspon a la posició 108.984.866 de AnAms1.0 i a la 110.230.748 de felCat9. Aquesta posició es troba dins d’un intró d’ENOX2, el gen codificador de proteïna més proper a ARHGAP36.

Deleció i coloració taronja

Toh et al. analitzaren per PCR mostres d’ADN de 40 gats a la recerca d’aquesta deleció. Trobaren que tots els gats calico d’aquesta subpoblació (un total de 6, 5 femelles i 1 mascle), i tots els gats carei (un total de 5) presentaven la deleció en 1 dels 2 cromosomes X. Així doncs, tots els calico i carei d’aquesta mostra presentaven la deleció en heterozigosi, incloent-hi el gat calico mascle, que probablement tindria una aneuploïdia XXY.

Dins d’aquests 40 gats, n’hi havia tres de pèl taronja sense clapes negres-brunes. En aquest cas la deleció era present en homozigosi (en femelles XX) o en hemizigosi (en mascles XY).

Dins d’aquests 40 gats, n’hi havia 26 sense pèl taronja. En cap d’ells no era present la deleció.

Si sumem els dos estudis, el de seqüenciació genòmica i el de PCR, tenim un total de 58 gats, 24 amb pèl taronja i 34 sense pèl taronja. Entre aquests gats la connexió entre la deleció i la coloració taronja és del 100%.

Si encara afegim les dades de 9 gats d’altres estudis, la xifra és de 67 gats, 26 amb pèl taronja i 41 sense pèl taronja. El vincle entre la deleció i el pèl taronja roman encara al 100%.

Pel que fa als 450 polimorfismes mononucleotídics esmentats com a exclusius del grup de gats de pèl taronja, només n’hi ha un que sigui compartit pels 10 gats de pèl taronja amb seqüenciació genòmica. Es tracta de la substitució C>T de la posició 109.185.709, situada a uns 500 pb en direcció 5` de la deleció esmentada.

Si hom amplia la base de dades als 258 gats dels quals es disposa de seqüència genòmica completa, la presència de l’esmentada deleció de 5,1 kb és present en 61 gats. D’aquests 61 gats n’hi ha 12 mascles que la presenten en hemizigosi, 12 femelles que la presenten en homozigosi i 28 femelles que la presenten en heterozigosi. Tots aquests 61 gats presenten el polimorfisme esmentat. Pel que fa als 197 gats sense la deleció, no n’hi ha cap que tingui el polimorfisme mononucleotídic esmentat. Val a dir que les 28 femelles heterozigotes per a la deleció també ho són per al polimorfisme mononucleotídic. Les dues mutacions es troben dins del mateix intró del gen ARHGAP36.

Elements ultraconservats de la regió delecionada

La seqüenciació pel mètode de Sanger de dideoxinucleòtids de productes de PCR confirmà la deleció. Es tracta d’una deleció de 5076 nucleòtids, que va de la posició 109.186.183 a la posició 109.191.258.

La comparació amb genomes no-felins, indica que dins d’aquesta regió hi ha una seqüència de 436 nucleòtids amb una forta conservació evolutiva. Segons dades del projecte ENCODE, en aquesta seqüència hi ha un clúster de llocs hipersensibles a la DNAasa I en cèl·lulers de neuroblastoma humà i clústers que respondrien a factors de transcripció com GATA2/3, max interactor 1, MXI1 i RCOR1. En aquesta llista de factors de transcripció n’hi ha d’activadors (GATA) i de repressors (MXI1 i RCOR1). Cal pensar que es pugui tractar d’un element cis-regulador, que pugui funcionar bé com a estimulador de la transcripció o com a repressor.

Pel que fa al polimorfisme mononucleotídic de la posició 109.185.709, aquest no es troba en una regió conservada entre espècies.

Toh et al. pensen que la deleció de 5,1 kb eliminaria una regió reguladora crítica. Sense aquesta regió reguladora hi hauria una alteració de l’expressió de gens propers, particularment de ARHGAP36.

Correlació negativa entre l’expressió del gen ARHGAP36 i gens de melanogènesi

Toh et al. prengueren mostres de pell de les orelles de tres gates calico d’aquest estudi (19, 20 i 22). Hi feren una seqüenciació d’ARN. Analitzaren els nivells d’expressió dels 13 gens codificacions de proteïna de la regió de l’haplotip. El gen ARHGAP36 era exclusivament expressat en la regió taronja de la pell. En canvi, tots els altres gens s’expressaven tant en la regió taronja, com en la negra-bruna o en la blanca.

El gat 1 de l’estudi, que era una femella calico, es va morir a les 3 setmanes de vida per raons desconegudes. Toh et al. en la necròpsia obtingueren mostres de teixit cutani. Les dades de seqüenciació d’ARN indicaven que el gen ARHGAP36 era expressat persistentment en les zones de color taronja, mentre que l’expressió en les regions negres-brunes era variable o, en un cas, inexistent.

Aquest patró d’expressió del gen ARHGAP36 era seguit també pel gen IGSF1, localitzat en una regió propera. Val a dir que el gen IGSF1 és de molt baixa expressió, amb menys de 0,6 fragments per kilobase d’exó per cada milió de lectures mapejades.

En les mostres de pell, l’única isoforma d’ARN missatger del gen ARHGAP36 és ARHGAP36-203. En les zones de pèl taronja, l’expressió d’ARHGAP36 es fa més constant. Toh et al. pensen que aquesta expressió constant promouria el canvi en la síntesi de pigments, afavorint la producció de feomelanina en detriment de l’eumelanina.

Segons la base de dades GTEx, ARHGAP36 i IGSF1 tenen la major expressió en teixits neuro-endocrinològics, com ara l’hipotàlam, la glàndula pituïtària o la glàndula adrenal. La proteïna IGSF1 fa part de la superfamília d’immunoglobulines, i defectes d’aquest gen produeixen en humans un cas d’hipotiroidisme vinculat al cromosoma X.

ARHGAP36 codifica una proteïna de la família de proteïnes activadores de la GTPAsa Rho. No obstant, sembla que la proteïna ARHGAP36 no té aquesta activitat. Sí que és capaç, en canvi, de mitjançar i activar la senyalització Hedgehog (HH) i de suprimir la senyalització PKA. Aquestes vies de senyalització són importants en el desenvolupament del fol·licle pilós i en la melanogènesi. Alteracions en el gen ARHGAP36 s’associen en humans amb la síndrome de Bazex-Dupré-Christol vinculada a cromosoma X.

L’estudi de correlacions d’expressió assenyala que en mostres de pell hi ha 341 gens amb correlació positiva amb el gen ARHGAP36 i 517 amb correlació negativa. Entre aquests 517 gens n’hi ha d’implicats en la melanogènesi, com ara ADCY7, DCT, LEF1, TCF7, TYR, TYRP1, WNT10B, WNT3A, WNT5A, i WNT6. La subexpressió d’aquests gens afavoriria la síntesi de feomelanina en detriment de l’eumelanina.

La inactivació del cromosoma X afecta l’expressió del gen ARHGAP36

No tots els gens del cromosoma X són afectats per la inactivació que condueix a la formació del corpuscle de Barr.

En cèl·lules de fibroblasts derivats de embrions femenins de ratolí amb una deleció que impedeix la inactivació del cromosoma X és possible discriminar entre gens que pateixen la inactivació o els que no ho fan. El gen Arhgap36 sí que la patiria en aquest model.

En línies cel·lulars humanes derivades de limfoblastoides i fibroblasts, el gen ARHGAP36 (=FLJ30058) és sotmès a inactivació del cromosoma X.

La metilació del gen ARHGAP36

En les bases de dades de seqüenciació genòmica amb bisulfit d’humans i de ratolins és possible avaluar dades de metilació d’ARN. Les illes CpG (CGIs) del gen ARHGAP36 presenten una metilació superior en femelles que en mascles tant en humans com en ratolins. La metilació és més elevada quan el gen Arhgap36 es troba en un cromosoma X inactiu.

Toh et al. han fet seqüenciació genòmica amb bisulfit de mostres de pell de la gata calico 1, així com de cèl·lules de sang perifèrica de la gata 4 i del gat 10. També han revisat dades semblants del gat Boris publicades en un altre estudi. Les 362 CGIs dels promotors de gens del cromosoma X tenien una major metilació en femelles que en mascles. Les 6 CGIs del gen ARHGAP36 també eren més metilades en femelles que en mascles. Això no passa en gens del cromosoma X que escapen a la inactivació com és el cas de KDM6A, MED14, i DDX3X, i que tenen poca o gens de metilació en els dos sexes.

Les posicions 109.204.156 (A/G) i 109.204.409 (C/A), situades en un CGI de ARHGAP36, són polimòrfiques, la qual cosa permet destriar entre una inactivació aleatòria o una inactivació per imprompta. El patró indicaria que la inactivació és aleatòria.

L’origen d’aquestes variacions genètiques

Els 24 gats de l’estudi amb pèls de color taronja presenten la deleció de 5,1 kb. Tots aquests gats procedeixen de l’àrea metropolitana de Fukukoa.

Dels 61 gats dels 258 gats de la 99 Lives Cat Genome Sequencing Initiative que tenen aquesta deleció, tenim animals procedents dels Estats Units, d’Europa i de l’Orient Mitjà. La presència de la deleció en gats d’origen tan divers suggereix un origen comú del fenotip taronja.

El patró calico, a banda de clapes taronges i negres-brunes, té regions blanques. Hom sap que aquest blanc és el resultat de la inserció d’un retrovirus endogen felí dins del gen KIT del cromosoma B1. Toh et al. han comprovat que els 25 gats del seu estudi amb color blanc tenen, ni que en heterozigosi, aquesta inserció. La inserció és absent en els altres 33 gats.

El hàmster daurat (Mesocricetus auratus) té coloració taronja degut a l’activitat del gen Sly, del cromosoma X. Toh et al. han comprovat que Sly i Arhgap36 ocupen regions diferents en el cromosoma X.

Queda pendent per esbrinar de quina manera la deleció provoca una alteració pigmentària en el pèl. També queda per comprovar si hi ha gats de pèl taronja que no presenten la deleció. Un altre aspecte rellevant seria constatar si la deleció té altres efectes biològics més enllà de la coloració.

Lligams:

- A deletion at the X-linked ARHGAP36 gene locus is associated with the orange coloration of tortoiseshell and calico cats. Hidehiro Toh, Wan Kin Au Yeung, Motoko Unoki, Yuki Matsumoto, Yuka Miki, Yumiko Matsumura, Yoshihiro Baba, Takashi Sado, Yasukazu Nakamura, Miho Matsuda, Hiroyuki Sasaki. Current Biology (2025).