La funció de la senescència cel·lular en el dany i en la recuperació hepàtiques

Biologia cel·lular: La senescència cel·lular es defineix a partir de la presència de marcadors moleculars com p16^Ink4a. El grup de recerca de Bin Zhou, professor adjunt distingit de l’Acadèmia Xinesa de Ciències, treballa en traçabilitat de llinatge i plasticitat cel·lular, i ha aplicat la genètica interseccional per traçar i manipular tipus cel·lulars p16^Ink4a+. Ho expliquen en un article a la revista Cell, amb Huan Zhao de primer autor. Zhao et al. han generat eines genètiques in vivo en un model de ratolí al voltant de la p16^Ink4a: Sn-pTracer per traçar-la; Sn-cTracer per a eliminar cel·lules portadores; i Sn-gTracer per fer-hi manipulacions gèniques. Aquestes eines són específiques de tipus cel·lular. Així troben que les subpoblacions senescents de macròfags i de cèl·lules endotelials juguen papers diferents en un model de dany i reparació hepàtica. Així els macròfags senescents afavoreixen el dany hepatocel·lular, mentre que els endoteliòcits senescents mitiguen el dany hepàtic. Aquest rol protector dels endoteliòcits senescents es veu enfortit si se’ls fa sobreexpressar Kdr, contribuint a una reducció marcada de la fibrosi hepàtica. Zhao et al. ens mostren una vegada més que la senescència cel·lular juga un paper en la regeneració i en la malaltia, però adverteixen que les futures teràpies senolítics haurien de prendre en consideració les diferències que presenta cada tipus cel·lular.

Zhao et al. troben en un model de ratolí que l’eliminació de macròfags senescents p16^Ink4a+ pal·lia la fibrosi hepàtica. Ara bé, l’eliminació de cèl·lules endotelials senescents p16^Ink4a+ dificulta la reparació del dany hepàtic. Tot plegat indica que la senescència té rols funcionals diferents segons el tipus cel·lular.

La senescència cel·lular

En el 1961 els estudis de cultiu cel·lular in vitro fets pel grup de recerca de Leonard Hayflick establiren que hi havia un límit en el nombre de resembres d’aquests cultius. Així hom definí un ‘límit de Hayflick’, que variava proporcionalment a la longevitat de l’espècie de partida. El límit de Hayflick s’associava a la senescència cel·lular. En les darreres dècades ha crescut el coneixement sobre el rol de la senescència cel·lular en la fisiologia (desenvolupament, envelliment) i en la patologia (càncer, malalties degeneratives). La senescència cel·lular no tan sols depèn de factors endògens, sinó que es pot veure accelerada per estrès exogen.

Inicialment el límit de Hayflick s’assolia quan una població cel·lular ja no pot prosseguir el seu cicle de divisió. L’aturada del cicle cel·lular s’explica per l’expressió de proteïnes inhibidores de la cinasa dependent de ciclina (CDK) com són la p16^Ink4a o la p21^CIP1. Un altre marcador de la senescència de l’activitat beta-galactosidasa (SA-β-Gal), però també hi ha un fenotip secretori associat a la senescència (definit per quimiocines, interleucines, factors de creixement, proteases remodeladores de teixit, etc.).

Zhao et al. són del parer que la conseqüència funcional de la senescència cel·lular depèn del tipus cel·lular concret. Per seguir aquesta conseqüència funcional cal definir un marcador concret, i ells opten, com fan molts altres grups, per p16^Ink4a. Aquesta proteïna inhibeix CDK4/6, la qual cosa condueix a una dificultat en la progressió del cicle cel·lular des de la primera fase de creixement (fase G1) a la fase de replicació de l’ADN nuclear (fase S). En ratolins joves i sans la proporció de cèl·lules p16^Ink4a+ és gairebé indetectable, però n’hi ha una acumulació en teixits de ratolins vells o malalts.

Hom ha assajat procediments senolítics que actuen a través de l’eliminació selectiva de cèl·lules p16^Ink4a+. En ratolins la senolisi actua de manera generalment favorable. Ara bé, també comporta alguns aspectes negatius, ja que cèl·lules senescents participen en processos de supressió de tumors, desenvolupament embrionari, cicatrització de ferides, creixement de pèl, etc. Aquesta contradicció aparent, sostenen Zhao et al., s’explica per diferències de tipus cel·lular.

Una diversitat de tipus cel·lulars senescents

La proteïna p16^Ink4a és el producte del gen Cdkn2a. Zhao et al. han generat una nova línia reportadora a través de fluorescència que han denominat p16-tdT. Per fer-ho han inserit un casset tdTomato (tdT) després del gen endogen Cdkn2a. Així han aconseguit ratolins amb un al·lel p16-tdT.

A partir d’embrions de ratolins p16-tdT en l’estadi E-13,5, Zhao et al. obtenien fibroblasts MEFs. En subcultivar-los repetidament in vitro aquests MEFs desenvolupaven ja a partir del passatge 6 un augment de marcadors senescents (augment de SA-β-Gal i reducció de Ki67). Per immunohistoquímica i citometria de flux específica de tdT podien seguir l’augment d’aquesta senescència.

Zhao et al. seguiren en ratolins p16-tdT de diferents edats l’expressió de tdT. Observaren un augment general amb l’edat. En el cervell de ratolins vells, les cèl·lules p16^Ink4a+ són predominantment neurones del còrtex cerebel·lar. En el pàncrees de ratolins vells, les cèl·lules p16^Ink4a+ solen ésser cèl·lules endocrines dels illots de Langerhans.

Zhao et al. intentaren generar ratolins que tinguessin un al·lel nul per al gen p16^Ink4a, però sense poder marcar així les cèl·lules. Optaren alternativament per inserir un casset CreER en l’extrem 3′ del gen p16^Ink4a. Creuaren els ratolins p16-CreER resultants amb ratolins R26-tdT, i comprovaren que els ratolins p16-CreER;R26-tdT presentaven un augment de cèl·lules tdT⁺ en múltiples teixits.

Caracterització dels tipus cel·lulars p16^Ink4a+ d’un model de fibrosi hepàtica

La fibrosi hepàtica consisteix en una deposició excessiva de matriu extracel·lular, com a conseqüència de l’activació i proliferació de miofibroblasts. En ratolins hom pot induir fibrosi en la zona pericentral del fetge amb l’exposició a tetraclorur de carboni (CCl₄) durant vuit setmanes.

Zhao et al. induïren així fibrosi hepàtica en ratolins p16-tdT. Les imatges de fluorescència indicaven un augment del senyal tdT en fetges de ratolins exposats a CCl₄ en comparació amb ratolins exposats a oli.

Zhao et al. feren anàlisis immunohistològics dels fetges afectats amb marcadors específics de tipus cel·lular, com HNF4α (hepatòcits), PDGFRα (fibroblasts), PDGFRβ (perícits), F4/80 (macròfags), CDH5 (endoteliòcits). El senyal tdT s’associava amb subpoblacions de fibroblasts, endoteliòcits i macròfags, però amb prou feines ho feia amb hepatòcits. Les anàlisis de citometria de flux indicaven expressió de tdT en el 14,41% ± 1,63% dels macròfags CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺ i en el 13,76% ± 1,38% dels endoteliòcits CD45⁻CD31⁺. Això era confirmat amb la seqüenciació d’ARN (scRNA-seq) de cèl·lules no-parenquimals.

Zhao et al. aïllaren macròfags i endoteliòcits p16^Ink4a+ per fer-hi un perfil d’expressió gènica. El perfil era propi de cèl·lules senescents.

En una altra sèrie d’experiments, ratolins p16-tdT eren sotmesos a una alimentació deficient en colina. Això condueix a una esteatohepatitis no-alcohòlica. El fetge d’aquests ratolins mostrava una gran proporció de cèl·lules tdT⁺, particularment macròfags i endoteliòcits. L’anàlisi scRNA-seq confirmava el caràcter senescent d’aquestes cèl·lules.

La traçabilitat genètica de cèl·lules p16^Ink4a+ en el dany i en la reparació hepàtiques

El sistema Sn-pTracer permet Zhao et al. de seguir el destí cel·lular. Aquest sistema funciona amb un pols de tamoxifen (a través de la casset Cre). Creuaren doncs línies cel·lulars amb ratolins amb construccions p16-CreER i R26-RL-tdT, obtenint ratolins F4/80-Dre;p16-CreER;R26-RL-tdT i Cdh5-DreER;p16-CreER;R26-RL-tdT. En aquests ratolins el tractament amb tamoxifen promou l’expressió de tdT o bé en macròfags (F4/80-Dre;p16-CreER;R26-RL-tdT) o en endoteliòcits (Cdh5-DreER;p16-CreER;R26-RL-tdT).

Ratolins SnMø-pTracer eren tractats amb tamoxifen i CCl₄. D’aquesta manera hom podia tenir un marcatge específic dels macròfags senescents durant el dany hepàtic. Vora un 9% dels macròfags eren senescents. Després de les vuit setmanes d’administració de CCl₄ segueix un procés de recuperació hepàtica, en el decurs del qual desapareixen aquests macròfags senescents, fonamentalment per apoptosi.

Ratolins SnEC-pTracer foren tractats amb tamoxifen i CCl₄. El dany hepàtic comportava un augment dels endoteliòcits senescents, que arribaven al 10%. En la recuperació hepàtica ulterior aquesta proporció es mantenia, però els marcadors de senescència d’aquesta subpoblació es veien reduïts.

L’ablació genètica de macròfags p16^Ink4a+ millora la fibrosi hepàtica

Zhao et al. desenvoluparen un sistema Sn-cTracer, amb el qual registraven les cèl·lules p16^Ink4a+ sense dependre d’una administració continuada de tamoxifen. Així generaren una línia de ratolins p16-LSL-Dre, que creuaren amb ratolins R26-iCre i R26-RSR-tdT. Resultaren uns ratolins Cd68-Cre;p16-LSL-Dre;R26-RL-tdT-DTR. En aquest model l’administració de toxina diftèrica condueix a l’ablació de macròfags senescents. L’ablació d’aquests macròfags protegeix front la fibrosi induïda per CCl₄.

Els endoteliòcits p16^Ink4a+ participen en la reparació hepàtica

En ratolins Cdh5-CreER;p16-LSL-Dre;R26-RL-tdT-DTR, els endoteliòcits senescents persisteixen durant el procés de recuperació hepàtica posterior a l’administració de CCl₄. L’administració de toxina diftèria en aquest model condueix a l’ablació específica d’endoteliòcits senescents: el resultat és una major persistència de la fibrosi durant el període de recuperació.

En altres experiments Zhao et al. comproven com la promoció de l’expressió de Kdr reforça el rol reparador dels endoteliòcits senescents en la recuperació hepàtica. Kdr és un receptor de la via de senyalització de VEGF, rellevant en l’angiogènesi.

Senòlisis més específiques

Zhao et al. consideren que aquests resultats indiquen la importància de fer una recerca específica de tipus cel·lular quan hom s’adreça a la senescència cel·lular o a estratègies senolítiques.

Des d’un punt de mira tecnològic, Zhao et al. ens ofereixen fins a quatre sistemes d’estratègies genètiques per a l’estudi de cèl·lules p16^Ink4a+.

Lligams:

- Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Huan Zhao, Zixin Liu, Hui Chen, Maoying Han, Mingjun Zhang, Kuo Liu, Hengwei Jin, Xiuxiu Liu, Mengyang Shi, Wenjuan Pu, Markus Werner, Michael Meister, Stefan G. Kauschke, Ruilin Sun, Jinjin Wang, Ruling Shen, Qing-Dong Wang, Xin Ma, Jan S. Tchorz, Bin Zhou. Cell (2024)

- Genòmica del rejoveniment de l’hidrozou ‘Turritopsis dohrnii’ (30/08/2022)