Teràpia molecular: L’hemocromatosi hereditària vinculada al gen HFE és provocada per mutacions de pèrdua de funció d’aquest gen. Sense un gen HFE funcional, apareix una absorció intestinal excessiva de ferro, i la consegüent deposició de ferro en el fetge. Vora el 80-90% dels casos són provocats per la variant C282Y. Sense tractament, aquesta alteració congènita del metabolisme condueix, a través de l’acumulació hepàtica de ferro, a la fibrosi hepàtica, la cirrosi i el carcinoma hepatocel·lular. En un article al Journal of Hepatology, el grup de recerca de Simon Krooss, amb Vanessa Hamann com a primera autora, presenta resultats preclínics d’una tècnica d’edició gènica. Es tracta d’un sistema ARNm editor de base amb un sol ARN guia, administrat per nanopartícules lipídiques, capaç de corregir in vivo la mutació C282Y del gen HFE en un model de ratolí d’hemocromatosi per exposició a ferro. La tècnica també ha estat assajada en cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC) derivades de pacient i en hepatòcits. En cultius d’hepatòcits murins la taxa de conversió és del 73,6 ± 4,9%. En el model in vivo, això baixa a 67%. Hamann et al. no detecten efectes en altres punts del genoma. Els ratolins tractats, malgrat continuar exposats a una alta ingesta de ferro, veuen reduïda la sobrecàrrega hepàtica de ferro, i l’anàlisi transcriptòmica indica menors senyals de fibrosi i càncer. Quan la tècnica és aplicada hepatòcits derivats d’iPSCs de pacients homozigots per a la variant C282Y, l’edició assoleix una taxa de correcció del 63,8 ± 0,8%. Hamann et al. consideren que és el moment de contemplar la translació d’aquesta tècnica cap a estudis clínics.
Hamann et al. han assajat en un model de ratolí d’hemocromatosi un sistema d’edició gènica de la variant C282Y del gen HCE. Hi troben una eficiència in vivo del 67%. Aquesta correcció gènica redueix els nivells hepàtics de ferro en aquest model bo i manteniment la dieta que indueix l’hemocromatosi. El perfil transcriptòmic resultant indica una atenuació de la fibrosi i del risc tumoral. La tècnica, aplicada a hepatòcits derivats de cèl·lules totipotents iPSC de pacient, aconsegueix una correcció del 63,8%. Això podria conduir a una teràpia gènica no-viral de l’hemocromatosi hereditària
L’hemocromatosi hereditària
La prevalença de l’hemocromatosi hereditària en les poblacions del nord d’Europa puja a 1:300-1:500, la qual cosa la converteix en una de les malalties hepatometabòliques més prevalents. En el 80-90% dels pacients, la mutació responsable és la variant C282Y del gen HFE. Aquesta variant comporta una pèrdua de funció de la proteïna HFE. Sense una proteïna HFE funcional, el cos tendeix a acumular ferro, especialment al fetge, la qual cosa comporta un augment del risc de desenvolupar-hi fibrosi, cirrosi i carcinoma hepatocel·lular. Alhora hi ha un major risc de patir diabetis i artropatia.
De fet quan un pacient té signes clínics d’hemocromatosi o valors persistentment elevats de saturació de transferrina i de ferritina, caldria fer-li un test genètic. En cas confirmat d’hemocromatosi hereditària, el tractament primari és la flebotomia, i el secundari, en cas de fallar el primer, és la quelació oral de ferro amb deferasirox.
Fins i tot quan la mutació C282Y es troba en heterozigosi, els homes portadors presenten un major risc de patir malaltia hepàtica. La proteïna amb la variant C282Y no pot interactuar amb els receptors 1 i 2 de la transferrina i, alhora, un mal plegament de la proteïna afavoreix processos d’estrès cel·lular.
El grup de Krooss ha treballat en un sistema de correcció gènica in vivo de la variant C282Y amb un editor de base d’adenina (ABE). Aquest sistema combina un vector viral (AAV8, que ha incorporat l’ABE7.10) i un ARN guia específic (sgRNA): això s’administra als ratolins per la vena de la cua. El problema d’aquesta aproximació és que el vector viral condueix a una expressió contínua del transgen, quan l’ideal seria una aproximació més puntual.
L’alternativa és un sistema d’administració no-viral, com ara les nanopartícules lipídiques (LNPs). Les LNPs poden incorporar l’ARNm terapèutic. L’avantatge és que són menys immunogèniques.
Hamann et al., doncs, treballen ara en un ABE mRNA i sgRNA incorporats a LNP per a corregir la mutació C282Y. Ho han provat en hepatòcits murins, en fetges de ratolí i en hepatòcits derivats de iPSC de pacients amb la mutació.
La producció de les nanopartícules
Les LNP-AB-mG17 foren formulades per Acuitas Therapeutics. TriLink Biotechnologies produeix ABEmax mRNA, amb la base modificada N1-metilpseudouridina (N1mΨ). Synthego produeix sgRNA mG17.
La producció de LNP-ABE-mG17 passa per una T-barreja de lípid ionitzable, DSPC, colesterol i ALC-159™ amb l’ARN (ABEmax:sgRNA 12,5:1 mol/mol; 1:1 p/p) diluït en tampó citrat acídic.
El model murí d’hemocromatosi
Els experiments en animals foren aprovats per LAVES (33.8-42502-04-22-00119 i 33.8-42502-04-23-00487_M). Els ratolins eren allotjats en gàbies individuals. Les soques utilitzades foren 129-Hfetm1.1Nca/J (C282Y; Jackson Laboratory #005063), BALB/cAnNCrl (CharlesRiver), and 129S2/SvPasOrlRj (JanvierLabs). Els ratolins BALB/cAnNCrl rebien injeccions de LNP-FLuc-P2A-GFP o de PBS, per tal de seguir per bioluminescència el camí de les LNPs. Els ratolins 129-Hfetm1.1Nca/ rebien injeccions de LNP per la vena de la cua, alhora que eren alimentats amb un pinso ric en ferro (25 g/kg carbonil-ferro, ssniff Spezialdiaeten).
Els hepatòcits derivats de iPSC
El punt de partida eren iPSCs derivades de pacients amb hemocromatosi hereditària. D’aquests iPSCs se n’obtenien cèl·lules d’aspecte d’hepatòcit amb el kit de diferenciació STEMdiff™ Hepatocyte Kit (STEMCELL technologies).
Les LNPs com a vehicle d’ARN
L’estudi amb ratolins Balb/C injectats amb LNPs carregades amb l’ARNm del gen de la luciferasa permetia fer un seguiment de la funcionalitat i seguretat d’aquesta aproximació.
L’efecte de la injecció de LNP-ABE-mG17 a ratolins 129-Hfetm1.1Nca/J era seguit a través dels valors de les transaminases al cap de 24 hores. Si bé, en ratolins mascles no s’observava efecte, en ratolins femelles els valors de les transaminases pujaven un ordre de magnitud, bo i que no hi havia canvis en la salut general, l’activitat o la massa corporal. Al cap d’una setmana les transaminases dels ratolins femelles tornaven als valor basals.
L’edició gènica en hepatòcits murins
Hepatòcits primaris de ratolins 129-Hfetm1.1Nca/J foren tractats amb LNP-ABE-mG17. Al cap de 5 dies, el 73,6 ± 4,9% havien patit l’edició gènica.
L’edició gènica en ratolins
L’administració endovenosa de LNP-ABE-mG17 a ratolins (amb una dosi de 2 mg/kg) resultava en un taxa d’edició hepàtica del 24,0 ± 6,4% al cap de 4 setmanes. Això s’associava amb una reducció del 41,3% dels nivells hepàtics de ferro i amb un augment del 40% de l’hepcidina sèrica. Altres paràmetres indicaven una millora, per bé que no s’arribava a una normalització completa (en comparació amb els ratolins control sense hemocromatosi).
La seqüenciació d’ARN del teixit hepàtic, indicava que el tractament modificava específicament l’expressió de cinc gens, entre els quals hi havia Smad9.
La seqüenciació de teixit de cervell, cor, pulmó, ronyó o gònades no mostrava indicis d’edició gènica, però sí que hi havia un nivell detectable, però baix, d’edició en melsa i pàncrees.
L’edició gènica en hepatòcits derivats d’iPSCs de pacient
Els pacients en qüestió són homozigots per a la mutació C282Y del gen HFE. Les iPSCs dels pacients representen el seu genoma, per bé que el procés d’obtenció pot conduir a insercions o delecions considerables. Un protocol de 21 dies permet aconseguir hepatòcits a partir de iPSCs. Aquests hepatòcits són un model preclínic per estudiar aquest teràpia gènica. L’edició amb LNP-ABE-hG17 hi té una taxa de correcció del 63,8 ± 0,8%, prou específica (per bé que en alguns hepatòcits s’indueixen mutacions T281A i Q283R).
L’eficiència del sistema supera en un factor de 5 el del sistema viral, i ho fa amb una sola administració. Ara caldran més estudis preclínics per a reduir al mínim les edicions indesitjades. Després serà el torn d’estudis immunològics i toxicològics en primats no-humans.
Lligams:
- In vivo base editing alleviates hepatic iron accumulation and fibrosis in models of HFE-related hereditary hemochromatosis. Vanessa Hamann ∙ Sebastian Hook ∙ Pimpan Sujariyakul ∙ Rajesvaran Ramalingam ∙ Malte Sgodda ∙ Isabel Klefenz ∙ Amelie Stalke ∙ Qinggong Yuan ∙ Lars Steinbrück ∙ Alice Rovai ∙ Marie Ruhe ∙ Bo Mee Chung ∙ Doris Steinemann ∙ Amar Deep Sharma ∙ Tobias Cantz ∙ Paulo J.C. Lin ∙ Heiner Wedemeyer ∙ Michael Ott ∙ Simon Alexander Krooss. Journal of Hepatology 85: 946-958 (2026).
