divendres, 16 d’abril de 2021

La quimerització d’embrions de ‘Macaca fascicularis’ amb cèl·lules pluripotents humanes

Biotecnologia: Tao Tan (de la Universitat Kunming de Ciència i Tecnologia, KUST), Jun Wu (del UT Southwestern Medical Center), Weizhi Ji, Yuyu Niu (KUST) i Juan Carlos Izpisua Belmonte són destacats investigadors en les cèl·lules mare pluripotents humanes (hPSC), és a dir en les cèl·lules troncals virtualment capaços de proliferar indefinidament i de diferenciar-se en tots i cadascun dels tipus cel·lulars de l’organisme. A mitjans de la dècada passada aconseguiren unes hPSC “esteses” (hEPSCs), en el sentit d’ésser capaces de donar lloc també a tipus cel·lulars extraembrionaris (els qui constitueixen la placenta). Aquesta setmana, en un article publicat a Science, aquests cinc investigadors i els seus col·laboradors comuniquen la generació ex vivo d’embrions quimèrics Homo sapiens-Macaca fascicularis amb l’ús d’hEPSCs. Inoculades en embrions de macaco, les hEPSCs s’hi diferenciaven en llinatges hipoblàstics i epiblàstics. Mitjançant un sistema d’anàlisi de seqüència per petits ARN condicionals, Tan et al. seguien les trajectòries de desenvolupament de les cèl·lules humanes i macaques. La formació de quimeres interespecífiques constitueix per als autors un model d’avaluació in vivo de la pluripotència de les hPSCs, però alhora també té un potencial per a la generació de teixits i òrgans per aplicacions de medicina regenerativa. Fins ara, els autors havien treballat sobretot amb embrions de ratolí i de porc, però trobaven obstacles per a la formació de quimeres. Pensant que aquests obstacles serien deguts a la llunyania taxonòmica de rosegadors i artiodàctils respecte d’humans, escolliren una espècie de primat no-humà, Macaca fascicularis, el mico cynomolgus. En aquests embrions, les hEPSCs sobreviuen, proliferen i es diferencien en llinatges cel·lulars. La finalitat de l’estudi és començar a identificar els processos de senyalització interespecífic que operen en una quimera d’aquesta mena, per poder traslladar aquest coneixement al model de porc i de ratolí.

Una recerca a la província de Yunnan

Tao Tan, Jun Wu, Weizhi Ji i Juan Carlos Izpisúa dissenyaren l’estudi i supervisaren tots els experiments. Chenyang Si i Youyue Zhang realitzaren les tasques al Laboratori de Recerca Biomèdica en Primats de la Província de Yunnan: superovulació, micromanipulació, etc. Altres autors contribuïren a la realització d’experiments, l’obtenció de reactius o el disseny de protocols. Les dades foren analitzades per Tan, Wu, Shaozing Dai, Pengpeng Yang i Ran Zhu. Tan, Wu, Dai, Ji i Izpisúa redactaren l’article, que fou tramès a la revista Cell el 29 de setembre del 2020. Després d’una revisió, completada el 25 de gener, l’article fou acceptat el 9 de març, i publicat el 15 d’abril.

Aquesta investigació fou finançada amb programes de recerca de la Xina i de la província de Yunnan, així com de la Universidad Católica de Murcia (UCAM) i la Moxie Foundation. Els autors agraeixen a David O’Keefe els seus comentaris, i al Programa d’Ètica en la Recerca de la Stanford University per les aportacions realitzades durant el procés de revisió de protocols.

Les cèl·lules troncals (stem cells, SC) o cèl·lules mare són les cèl·lules indiferenciades o parcialment diferenciades, que poden proliferar indefinidament o diferenciar-se en diversos tipus cel·lulars. Les cèl·lules troncals pluripotents (pluripotent stem cells, PSCs) serien capaces, no tan sols de renovar-se indefinidament en cultiu, sinó també de generar tots els tipus cel·lulars de l’organisme adult.

Les PSCs tindrien, doncs, un gran potencial en medicina regenerativa. Però aquest potencial passa per aconseguir-les en un gran nombre. L’addició de PSCs humanes (hPSCs) a embrions d’altres espècies (“complementació de blastocist” o “quimerització interespecífica”), conduiria a la generació de cèl·lules, teixits o òrgans humans, que es podrien destinar a transplantaments. Perquè aquesta estratègia funcioni, les hPSCs han de tindre “competència quimèrica”, és a dir la capacitat de proliferar i diferenciar-se en un embrió no-humà.

La competència quimèrica de les hPSCs sembla poc prometedora en embrions de ratolí o de porc. Una raó pot ésser l’apoptosi (o suïcidi cel·lular) de les hPSCs, i per això s’ha assajat la inhibició de l’apoptosi. Una altra estratègia seria inhibir les barreres xenogeneiques que actuarien en aquest sistema.

No totes les hPSCs són iguals, i formulacions de cultiu cel·lular diferents donen lloc a resultats diferents en termes de potencial quimèric. Hom pot estendre la capacitat de les hPSCs, i convertir-les en hEPSCs, les quals tenen una major capacitat quimèrica en embrions de ratolí.

Al Laboratori de Yunnan han aconseguit, paral·lelament, dissenyar un sistema de cultiu que permet el desenvolupament ex vivo d’embrions de M. fascicularis fins a 20 dies. És en aquest sistema que Tan et al. han microinjectat hEPSCs en blastocists de mico. Les hEPSCs són capaces d’integrar-se en les masses cel·lulars internes de blastocists tardans, i contribuir-hi tant a llinatges embriònics com extra-embriònics, tant en l’estadi corresponent a la implantació com en el directament ulterior.

Cèl·lules troncals pluripotents esteses humanes són capaces de quimeritzar embrions de macaco

Deu macaques foren seleccionades per a aquest estudi

Deu macaques (Macaca fascicularis), d’edats compreses entre 5 i 8 anys, i amb un pes corporal de 4 a 6 kg, foren seleccionades per a aquest estudi, conduït al LBPR de KUST.

Les cèl·lules troncals pluripotents esteses humanes (hEPS) eren cultivades sobre fibroblasts embriònics de ratolí (MEFs) en un medi N2B27-LCDM. Les sigles LCDM corresponen als quatre factors (LIF, CHIR99021, maleat de dimetindè i hidroclorur de minociclina) que faculten les hPSCs per esdevindré hEPSCs (iPS1-EPS).

A les deu macaques se’ls administrà per injecció intramuscular durant 8 dies alfa-fol·litropina humana recombinant (rhFSH), i en el dia 9è se’ls injectà alfa-gonatropina coriònica humana recombinant (rhCG). Entre 32 i 35 hores després d’aquesta darrera injecció es feia una recollida de complexos cúmulus-oòcit per aspiració fol·licular laparoscòpica.

Els oòcits recuperats eren tractats amb hialuronidasa per treure-hi les cèl·lules del cúmulus. Els oòcits madurs (amb el primer cos polar present, és a dir situats en la metafase II de la meiosi) eren sotmesos a una injecció intracitoplasmàtica d’espermatozoide, i passats a un medi de cultiu CMRL-1066. La fertilització era confirmada per la presència del segon cos polar i dels dos pronuclis. Els zigots eren seguidament cultivats en medi HECM-9.

En el dia 6è posterior a la fertilització (blastocist d’estat primerenc), els blastocists eren transferits a una placa de Petri. Era llavors que s’injectaven unes 25 hEPSCs. Els blastocists injectats eren transferits a un medi mixt i cultivats durant 24 hores fins a l’estadi de blastocist ben expandit.

Les cèl·lules humanes i macaques eren distingides per les seqüències nucleiques. Per immunofluorescència es feia un seguiment de les interaccions intercel·lulars.

La generació de blastocists quimèrics humà-macac in vitro

Tan et al. utilitzen una línia hEPSC ben caracteritzada, generada per la reprogramació LCDM: iPS1-EPSCs. Les iPS1-EPSCs, en cultiu in vitro, formen colònies amb aspecte de cúpula. Es caracteritzen per l’expressió dels tres factors de transcripció centrals en la pluripotència: OCT4, NANOG i SOX2.

Les iPS1-EPSCs eren marcades amb tdTomato (TD) en el moment previ a la injecció en blastocists primerencs de macaco. D’aquesta manera hom podia seguir-ne la proliferació en les 24 hores posteriors a la injecció. En 132 blastocists injectats TD+ iPS1-EPSCs, s’hi va poder detectar la presència de cèl·lules humanes en el 100% dels casos.

La contribució quimèrica d’hEPSCs a embrions de macaco en l’estadi post-implantació

El sistema d’implantació ex vivo permet a blastocists continuar l’embriogènesi fins a l’estadi de gastrulació. Per fer-ho, es retira del blastocist la zona pellucida, i se’l permet d’adherir-se a la superfície del cultiu.

La injecció de hEPSCs no afectava la implantació ex vivo. Així, si dels controls no-injectats (104), el 92,31% s’adherien, dels injectats (111) ho feia el 92,79%. La implantació tenia lloc en el dia 10 posterior a la fertilització. En el dia 11 ja era visible un disc embriònic.

La presència d’hEPSCs (seguida pel marcatge de TD) en els discs embrionaris davallava en el temps. En el dia 9 posterior a la fertilització (dia 3 posterior a la injecció), s’hi detectaven en una mica més de la meitat dels embrions injectats. Però en el dia 13, ja només s’hi detectava en un terç.

Les ratios de desenvolupament dels embrions injectats eren lleugerament inferior a la dels controls. De tota manera, embrions injectats o no-injectats comencen a fallar a partir del 15 en aquest model d’implantació ex vivo.

El marcatge de TD i la immunofluorescència per OCT4, NANOG i OCT4 permetia identificar la localització de les iPS1-EPSCs. Altres marcadors permetien afinar la posició dins de les masses embrionàries. Així deduïen una contribució raonable a l’epiblast (que arribava a un màxim del 7,08% en el dia 15). En l’hipoblast la contribució era menor (s’arribava a un màxim del 4,96% en el dia 19).

El paisatge transcripcional dels embrions quimèrics

L’anàlisi de scRNA-seq permet analitzar els transcriptomes de cèl·lules individuals en els embrions quimèrics. Els embrions eren dissociats, i es recollien manualment cèl·lules distingint-les per la presència o absència del marcador TD. En total seqüenciaren 227 cèl·lules humanes i 302 cèl·lules macaques, corresponents a diferents punts del desenvolupament embrionari (dies 9-17). Després d’un filtratge, es tingueren en compte únicament 200 cèl·lules humanes i 272 cèl·lules macaques. D’aquestes, de mitjana, s’hi detectaven 9.798 gens i 27.936.953 lectures.

La comparació amb els embrions control, permeté la identificació de gens que modificaven l’expressió en els embrions quimèrics. Entre les vies de senyalització deprimides en els embrions quimèrics hi havia la Hippo i la TGF-β.

La trajectòria de desenvolupament de les cèl·lules humanes en els embrions quimèrics

En l’epiblast dels embrions quimèrics trobem cèl·lules humanes en diferents estadis (des d’abans de la implantació fins a la gastrulació). El seu desenvolupament es troba endarrerit respecte de les cèl·lules macaques de l’embrió. De tota manera, hi ha indicis d’una adaptació transcriptòmica de les cèl·lules humanes en els embrions quimèrics, cosa que es manifesta en els perfils d’expressió d’un total de 315 gens. Entre aquests 315 gens trobem vies de senyalització (PI3K-Akt, MAPK, PPAR), així com reguladors (CHD2, POLR2A, RB1).

Biotecnologia de quimeres interespecífiques

La raó d’estudiar cèl·lules pluripotencials humanes en embrions quimèrics és esquivar els problemes ètics de fer-ho en embrions humans. Ara bé, la generació mateixa d’embrions quimèrics humans-animals genera també consideracions ètiques, encara més quan es tracta de l’ús d’embrions de primats. És per aquestes consideracions que Tan et al. focalitzen la seva recerca en embrions quimèrics ex vivo en els primers estadis (<20 dies després de la fertilització in vitro).

Hom parla d’embrions quimèrics en el sentit que en l’embrió receptor s’incorporen hPSCs. D’una banda aquest model forneix la possibilitat d’estudiar aspectes del desenvolupament humà primerenc que, altrament, s’haurien d’estudiar directament en embrions. De l’altra, aquests embrions quimèrics podrien constituir la base per a produir teixits i òrgans humans per a tractaments regeneradors o transplantadors.

Les tècniques de complementació interespecífica de blastocists s’han experimentat en rates i ratolins. Hom ha introduït PSCs de ratolí en blastocists de rata, i PSCs de rata en blastocists de ratolí. El resultat són embrions quimèrics interespecífics.

La capacitat de formar embrions quimèrics interespecífics per complementació de blastocists amb PSCs sembla més o menys proporcional a la proximitat filogenètica de les espècies implicades. Rates i ratolins són rosegadors, amb un ancestre comú de 21 milions d’any d’antiguitat. En canvi, les hPSCs mostren ineficiència en la formació de quimeres en ésser injectades a blastocists de ratolins i de porcs. Els humans pertanyen a ordres diferents a aquestes espècies, i per trobar-hi l’ancestre comú ens hauríem de remuntar més de 90 milions d’anys. Aquestes observacions s’han trobat tant en PSCs induïdes (iPSCs) com en SCs embrionàries (ESCs).

Les barreres xenogeneiques per a la formació d’embrions quimèrics podrien obeir a diferències en el desenvolupament embrionari, que afectarien a diferents processos biològics, com l’adhesió cel·lular, el reconeixement de lligands i receptors, la competició cel·lular, els ritmes del cicle cel·lular i els temps de desenvolupament. Conèixer amb més detall aquestes barreres xenogeneiques és una de les finalitats de l’estudi de Tan et al.

Tan et al. han seleccionat per al seu estudi una línia ben caracteritzada de hEPSC, i l’han fet créixer en condicions propícies (LCDM). Han aprofitat també el fet de poder mantindre ex vivo embrions de Macaca fascicularis fins a 19 dies després de la fertilització. Les hEPSCs donaven lloc en els embrions quimèrics a llinatges cel·lulars de l’epiblast, de l’hipoblast i a cèl·lules mesenquimals extra-embrionàries. En el cas de l’epiblast això seria possible en bona mesura pel fet que el programa de desenvolupament, si més no en aquesta fase, és comú en humans i macacos.

Les dades transcriptòmiques obtingudes en aquest estudi servirien per a dissenyar estratègies de modulació que augmentin la competitivitat de hPSCs per formar quimeres en embrions de ratolí o de porc. Tan et al. són conscients que seran més aviat aquests models, i no pas els primats no-humans, els que s’aplicaran en teràpies regeneratives.

Lligams:

- Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivo. Tao Tan, Jun Wu, Chenyang Si, Shaoxing Dai, Youyue Zhang, Nianqin Sun, E Zhang, Honglian Shao, Wei Si, Pengpeng Yang, Hong Wang, Zhenzhen Chen, Ran Zhu, Yu Kang, Reyna Hernandez-Benitez, Llanos Martinez Martinez, Estrella Nuñez Delicado, W. Travis Berggren, May Schwarz, Zongyong Ai, Tianqing Li, Concepcion Rodriguez Esteban, Weizhi Ji, Yuyu Niu, Juan Carlos Izpisua Belmonte. Cell 184: P2020-2032.E14 (2021).

- Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos, dades de seqüències obtingudes en aquest estudi dipositades a NCBI Gene Expression Omnibus.

Cap comentari: