Genètica molecular: Lluís Montoliu, del Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) y del CIBERER-ISCIII, de Madrid, es demana en el darrer número de la Revista del Col·legi de Biòlegs de Catalunya què podem esperar de les eines CRISPR durant aquesta pandèmia COVID-19. Ens recorda que ja en el març del 2020, Feng Zhang proposà l’aplicació del seu sistema SHERLOCK, basat en el sistema CRISPR Cas13a en la detecció de còpies genòmiques de SARS-CoV-2 en mostres clíniques. El cas és que durant tots aquests mesos el diagnòstic d’infecció per SARS-CoV-2 (covid-19) s’ha fet fonamentalment a través de tecnologies d’amplificació (RT-PCR i TMA) i de tests d’antígens. Això entranya una dificultat en el seguiment de les variants de SARS-CoV-2, que es fa amb l’ús de tècniques de seqüenciació genètica, aplicades únicament a una petita mostra dels casos positius de covid-19. James J. Collins, del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de la Harvard Institute, és l’autor corresponsal d’un article a Science Advances, encapçalat per Helena de Puig, Rose A. Lee i Devora Najjara, en el que es presenta una tècnica SHERLOCK d’instrumentació mínima (miSHERLOCK) per al diagnòstic d’infecció de SARS-CoV-2 i de les variants emergents d’aquest virus. Disposar d’una tècnica així possibilitaria identificar en la saliva de cada pacient de covid-19 quina o quines variants de SARS-CoV-2 l’infecten. La saliva és introduïda a la plataforma de diagnòstic sense processar: hi segueix una extracció, purificació i concentració d’ARN viral, amb reaccions d’amplificació i detecció, que són detectades per fluorescència. L’usuari tan sols hi ha de de fer tres accions, i en una hora obté resposta. La plataforma és capaç d’oferir resultats sobre la presència de SARS-CoV-2 i sobre mutacions associades amb les variants 20I (Alfa, V1), 20H (Beta, V2) i 20J (Gamma, V3). La modularitat del sistema permet un fàcil bescanvi d’assaigs per adaptar-se a les necessitats de l’usuari. També compta amb una aplicació de mòbils per a quantificació de resultats, interpretació automatitzada i distribució remota de les dades.
El dispositiu miSHERLOCK
CRISPR i SHERLOCK
Helena de Puig, Rose A. Lee, Devora Najjar i Xiao Tan dissenyaren i realitzaren experiments, analitzaren les dades i redactaren l’article. Luis R. Soekensen, Nicolaas M. Angenent-Mari, Nina M. Donghia, Nicole E. Weckman, Carlos F. Ng, Peter Q. Nguyen, Audrey Ory, Angelo S. Mao, Thomas C. Ferrante, Geoffrey Lansberry, Hani Sallum i James Niemi realitzaren experiments i editaren l’article. James J. Collins dirigí la recerca i edità l’article, del qual és l’autor corresponsal. Cal recordar que Collins és cofundador i director de Sherlock Biosciences, mentre que Weckman és cofundadora i consultora de 52 North Health Ltd. Els autors agraeixen a M. A. English discussions i assessorament. La recerca es finança a través del Paul G. Allen Frontiers Group, el Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, i dels projectes de Puig, Lee, Tao i Angenent-Mari.
El sistema CRISPR/Cas constitueix un element de la immunitat adaptativa de bacteris i, en aquest sentit, es caracteritza per l’especificitat de resposta a seqüències genètiques. Aquesta especificitat fa que hom l’utilitzi en aplicacions d’edició genètica, però encara més dreturer és utilitzar-lo en diagnòstic molecular.
L’acrònim CRISPR fa referència a repeticions palindròmiques breus regularment espaiades en clústers. L’acrònim SHERLOCK es construeix a partir de “specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking”, i aprofita Cas13a (o Cas12a) per detectar seqüències nucleotídiques específiques.
En el decurs de tots aquests mesos, s’han desenvolupat tests basats en SHERLOCK o en DETECTR per al diagnòstic de la infecció de SARS-CoV-2, però el cert és que no poden oferir gaire més d’allò que ofereixen els altres tests (RT-PCR, TMA, tests d’antígens). El repte de diagnòstic rau en la identificació de variants de SARS-CoV-2, i de mutacions com S:N501Y, S:E484K, que ara es fa en centres especialitzats de seqüenciació: hom té doncs dades epidemiològiques de les variants i de les mutacions de SARS-CoV-2, però en la immensa majoria de pacients de covid-19 no hi ha més que la dada del diagnòstic general.
Puig et al. presenten un miSHERLOCK, és a dir una variant de SHERLOCK d’instrumentació mínima, capaç de la detecció universal de SARS-CoV-2 i de les variants Alpha, Beta i Gamma en mostres de saliva en un sistema autocontingut i de baix cost que fa possible utilitzar-lo en centres d’assistència primària. La plataforma utilitza un mètode de captura d’ARN en paper, amb ulterior amplificació in situ i detecció per Cas. El límit de detecció són 1000 còpies genòmiques/mL. Com a mostra clínica utilitza la saliva, i això fa que el sistema hagi d’incorporar una etapa de filtració i concentració. Encara que el sistema únicament considera les mutacions N501Y i E484K, s’hi poden integrar d’altres com la Y144del.
El disseny del sistema
Per garantir la detecció universal de SARS-CoV-2, s’utilitzaren 43.305 seqüències completes obtingudes de NCBI i alineades amb MAFFT. Per a la variant Alfa, s’empraren 50.001 seqüències genòmiques; per a la variant Beta, 577; per a la variant Gamma, 78.
La seqüència de Cas12 gRNA consta d’una regió de mànec (UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU), que permet el reconeixement i unió de la proteïna Cas, i d’una regió adjacent a 3’ que defineix l’usuari segons quina ha d’ésser la diana diagnòstica.
Per a l’amplificació RPA es dissenyaren de 10 a 21 encebadors en els dos sentits per cada diana, amb una longitud d’entre 25 i 40 nucleòtids, i que haurien de donar lloc a amplicons de 100 a 200 parells de nucleòtids.
Com a subjectes experimentals s’utilitzaren mostres clíniques desidentificades procedents de la República Dominicana, i obtingudes a través de Boca Biolistics.
També s’utilitzaren mostres clíniques simulades, elaborades a partir de ATCC VR-1986HK, un preparat inactivat per calor de SARS-CoV-2, que eren abocades a aigua o a saliva humana (adquirida a BioIVT).
Utilitzaren els coronavirus endèmics OC43 i 229E, adquirits d’ATCC, en els experiments d’especificitat.
De Twist Bioscience s’adquiriren variants de SARS-CoV-2 Alfa, Beta i Gamma. També es generaren mutacions sintètiques.
Una vegada seleccionats els reactius, s’utilitzà el programari CAD per dissenyar la plataforma. Els components del sistema foren fabricats amb una impressora 3D en resina negra.
L’aplicació mòbil associada a la plataforma fou construïda amb Xcode, C++, Objective-c, OpenCV 3.1 i Swift.
Construïda la plataforma, es validà amb mostres de pacients.
La diana seleccionada: una regió del gen N
La regió 3’ del genoma dels coronavirus és la més interessant per a les tècniques de detecció, ja que apareix en còpies subgenòmiques produïdes en el decurs de la infecció. En aquesta regió trobem el gen N, que codifica per a la nucleocàpside, proteïna del virió que entra en contacte amb el genoma viral. Puig et al. seleccionaren una regió del gen N altament conservada i característiques de SARS-CoV-2.
El sistema SHERLOCK consta de dos components, un dedicat a l’amplificació isotèrmica de la seqüència diana, i l’altre dedicat a la detecció mediada per Cas de l’amplicó. Aquesta amplificació isotèrmica s’aconsegueix amb un sistema de recombinasa i polimerasa (RPA). És definida pel parell d’encebadors emprats i pels ARN guia (gRNAs). Dels 30 gRNA assajats per Puig et al., el millor és idèntic al 90,7% de les 43.000 seqüències genòmiques contemplades de SARS-CoV-2: l’excepció es deu en un 7,4% dels casos a un polimorfisme C>T de la regió 3’, que no seria problema per a la detecció de Cas12a. Dels 100 parells d’encebadors assajats per Puig et al., el millor és idèntic al 97% dels genomes contemplats.
Puig et al. aconsegueixen percentatges més alts i tot per als gRNA i encebadors dissenyats per a la detecció específica de les variants Alfa, Beta i Gamma.
En les proves realitzades el límit de detecció de l’ARN de SARS-CoV-2 dissolt en aigua per part del miSHERLOCK és de 20.000 còpies/mL, amb un temps de reacció de 55 minuts. No hi ha indicis de reactivitat creuada amb els betacoronavirus endèmics OC43 i 229E.
La mutació S:N501Y, que resulta del polimorfisme A23063U és compartida per les variants Alfa, Beta i Gamma. El gRNA i els encebadors seleccionats per Puig et al. són altament específics per a aquesta mutació, per bé que escapen algunes subvariants amb un polimorfisme G>A en la posició +7 de l’encebador.
La mutació S:Y144del, que resulta d’una deleció de 3 nucleòtids, és característica de la variant Alfa, i permet diferenciar-la de les variants Beta i Gamma. El gRNA i encebadors seleccionats per Puig et al. permeten a miSHERLOCK de discriminar clarament la variant Alfa de la variant originària.
La mutació S:E484K, deguda al polimorfisme G23012A, és present a les variants Alfa, Beta i Gamma, i és potser la més rellevant en termes clínics. El gRNA i encebadors seleccionats per Puig et al. permeten discriminar-la.
La simplificació de passes.
El sistema miSHERLOCK s’adreça a usuaris no-especialistes, que l’operaran sobre mostres de pacients en l’atenció primària, en una oficina de farmàcia o inclús en un entorn no-sanitari. Puig et al. han fet un esforç d’enginyeria per simplificar-ne l’operació. Per això han optimitzat tampons, retrotranscriptases i sistemes de fluorescència. Per exemple, l’addició de la ribonucleasa H (enzim que degrada ARN) millora la cinètica de reacció i augmenta la producció de fluorescència del sistema de detecció.
Puig et al. han adaptat el seu sistema a l’anàlisi de saliva, i no pas a hisops nasofaringis o nasals. La saliva, al capdavall, és més fàcil de collir. Ara bé, aquesta saliva ha d’ésser tractada prèviament, ja que les nucleases salivals podrien generar falsos positius en atacar els reportadors fluorescents. Alhora, el tractament ha de disminuir la viscositat de la saliva, i augmentar l’accessibilitat del material genòmic d’aquesta matriu. El tractament de la saliva que fa el miSHERLOCK inactiva les nucleases (amb ditiotreitol i EGTA), lisa les partícules virals presents (a una temperatura de 95°C), i concentra els àcids nucleics resultants en una membrana porosa (de polietersulfona).
El resultat final del tractament de la saliva és la captura d’àcids nucleics. Llavors comença la reacció pròpiament dita, a una temperatura de reacció de 37°C. Si és present l’àcid nucleic diana, hi ha una generació de fluorescència.
El conjunt del dispositiu diagnòstic té un cost de 15 dòlars USA, i cada assaig costaria 6 $, un preu que es deu sobretot als components enzimàtics de les reaccions d’amplificació i detecció.
L’aparell en funcionament
L’usuari introdueix 2 mL de saliva en el col·lector. Seguidament, activa l’escalfador de l’aparell. En 3-6 minuts, es produeix la deposició de l’ARN salival en la membrana. Llavors l’usuari ha de retirar el col·lector i transferir la columna de preparació de mostra a la cambra de reacció. Llavors s’inicia una reacció de 55 minuts, al cap dels quals l’usuari podrà constatar el positiu a través de la visualització de fluorescència sota el transil·luminador.
Una aplicació mòbil ajuda a la quantificació automatitzada i a la interpretació de resultats. Els valors positius i negatius poden ésser enviats a una base de dades en-línia.
El límit de detecció de miSHERLOCK per a la detecció universal de gen N de SARS-CoV-2 és de 1240 còpies genòmiques/mL. Per posar-ho en context, direm que xifres semblants hem assolit en les aigües residuals de l’àrea metropolitana de Barcelona en els pics de la pandèmia. Els límits de detecció són semblants per a la detecció de les mutacions Y144del i E484K, però són superiors en el cas de la detecció de la mutació N501Y (49000 còpies/mL).
Amb l’ús de 27 mostres de pacients de covid-19 i de 21 mostres control, Puig et al. han obtingut per al seu dispositius una sensibilitat del 96% i una especificitat del 95%.
Perspectives d’aplicació en l’actual context
A hores d’ara tothom és conscient de la importància de disposar de dades precises sobre les variants de SARS-CoV-2 presents en cada context geogràfic i social. El dispositiu de Puig et al. té una gran potencialitat per dissenyar múltiplex de mutacions de SARS-CoV-2 que ens donin informació de la variant concreta que infecta cada pacient. El cost de la prova se situaria al voltant dels 11 $ en el cas d’assaig dúplex.
Quin avantatge ofereix conèixer la variant de SARS-CoV-2 que afecta un pacient? De moment, poca, ja que els protocols que se seguirien d’aïllament i de tractament no difereixen d’acord amb les variants. Però és possible que el desenvolupament i aplicació de tractaments serològics sí requereixi d’un coneixement de la variant que infecta cada pacient. En un escenari d’emergència de variants que escapessin als vaccins, disposar de tècniques que permetin augmentar el nombre de mostres utilitzats al seguiment genòmic del SARS-CoV-2 serà essencial. I aquest escenari potser ens espera d’un moment a l’altre.
Lligams:
- Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants. Helena de Puig, Rose A. Lee, Devora Najjar, Xiao Tan, Luis R. Soekensen, Nicolaas M. Angenent-Mari, Nina M. Donghia, Nicole E. Weckman, Audrey Ory, Carlos F. Ng, Peter Q. Nguyen, Angelo S. Mao, Thomas C. Ferrante, Geoffrey Lansberry, Hani Sallum, James Niemi and James J. Collins. Science Advances 7: eabh2944 (2021).
Cap comentari:
Publica un comentari a l'entrada