Virologia: Cada nova onada de covid-19 es manifesta no tan sols d’una forma aguda sinó també d’una forma subaguda en la persistència de símptomes en una fracció gens negligible dels qui han superat la infecció aguda. En la covid persistent, les manifestacions neurològiques constitueixen una part important de la morbiditat global. Una de les qüestions obertes és com el SARS-CoV-2 arriba a produir una afectació en el sistema nerviós central. És sabut que el SARS-CoV-2 accedeix principalment a les cèl·lules per un procés d’endocitosi després d’haver interactuat amb la proteïna de membrana ACE2 (enzim 2 de conversió de l’angiotensina). Però l’expressió de l’ACE2 és pràcticament residual. El laboratori de Chiara Zurzolo sobre el rol del tràfic transmembrana en la patogènesi, de l’Institut Pasteur, proposa en un article a Science Advances que els nanotubs tuneladors poden constituir una ruta per a la dispersió de SARS-CoV-2. En cultius cel·lulars han mostrat que cèl·lules neuronals humanes, que no poden infectar-se a través de la via endocítica, sí es poden infectar si se les co-cultiva amb cèl·lules epitelials infectades de SARS-CoV-2. El SARS-CoV-2 indueix la formació de nanotubs tuneladors (TNTs) en la cèl·lula infectada, els quals arriben a les neurones del co-cultiu i, a través d’ells, hi penetra el SARS-CoV-2. L’article detalla a través de tècniques microscòpiques de fluorescència i de tomografia crio-electrònica que el SARS-CoV-2 s’associa als TNTs intercel·lulars: a dins observen estructures vesiculars múltiples (vesícules de doble membrana), on el virus es replica.
Pepe et al. han emprat diverses tècniques microscòpiques per seguir el curs del SARS-CoV-2 en cultius cel·lulars. Els túnels de nanotubs (TNTs) permeten el SARS-CoV-2 d’accedir a cèl·lules neuronals que no li serien accessibles a través dels receptors habituals.
Cultius cel·lulars per investigar com el SARS-CoV-2 infecta neurones
Aquests experiments foren concebuts pels investigadors de l’Institut Pasteur Anna Pepe, Stefano Pietropaoli, Giovanna Barba-Spaeth i Chiara Zurzolo. Pepe i Zurzolo són membres de la Unité de Trafic Membranaire et Pathogénèse del Département de Biologie Cellulaire et Infection. Pietropaoli i Barba-Spaeth són membres de l’Unité de Virologie Structurale del Département de Virologie. Pepe preparà les imatges i redactà la proposta inicial d’article; també realitzà el co-cultius i les quantificacions de TNTs i d’infecció per immunofluorescència; i establí i realitzà tots els experiments co-relatius de criomicroscòpia i de reconstrucció tomogràfica. Pietropaolí formà Pepe en el maneig del SARS-CoV-2 i de les cèl·lules infectades; alhora realitzà l’assaig de formació de focus i les tècniques immunològiques. En la discussió de resultats participaren Pepe, Pietropaoli, Matthijn Vos (de la Plateforme Technologique Nanoimagerie de l’Institut Pasteur), Barba-Spaeth i Zurzolo. Zurzolo, qui concebé el projecte, supervisà tota la feina. Zurzolo, Vos i Barba-Spaeth contribuïren a l’adquisició de fons, procedents de la campanya “Urgence Covid-19”, de l’Equipe Fondation Recherche Médicale i de l’Agence Nationale de la Recherche. Els autors tenen paraules d’agraïment per a companys de l’Institut Pasteur.
El desembre del 2019 foren descrits els primers casos d’allò que ara anomenem malaltia coronavírica del 20219 (covid-19). Aquesta és la malaltia provocada per la infecció del SARS-CoV-2, virus descobert aleshores. En general, la infecció per SARS-CoV-2 afecta principalment el tracte respiratori. Més enllà dels símptomes respiratoris de la covid-19, la infecció per SARS-CoV-2 pot presentar manifestacions intestinals, hepàtiques, renals i neurològiques. Els símptomes neurològics de la covid-19 poden ser aguts o persistents.
Val a dir, que hom ha trobat en autòpsies de pacients morts de covid-19 que el seu teixit cerebral presentava ARN de SARS-CoV-2. Això indica que, efectivament, el SARS-CoV-2 és capaç d’arribar al sistema nerviós central, quelcom que ja s’havia descrit pel SARS-CoV-1 i pel MERS-CoV.
La via d’entrada del SARS-CoV-2 a les cèl·lules és la unió de la proteïna S (Spike) del virus al domini enzimàtic del receptor cel·lular ACE2 i, seguidament, es produeix l’endocitosi viral i la fusió de la membrana vírica amb la membrana cel·lular. La fusió de membranes es pot fer per l’activació proteolítica de la proteïna S en l’endosoma, o bé per l’acció del TMPRSS2 en la pròpia membrana citoplasmàtica. Això provoca diverses qüestions quan es tracta de l’entrada del SARS-CoV-2 en neurones. Primer, cal entendre els mecanismes pels qual el SARS-CoV-2 és capaç de creuar la barrera hematoencefàlica. D’altra banda, hi ha la qüestió de l’expressió diferencial de l’ACE2. El receptor ACE2 és ben present en les cèl·lules de la mucosa oral i orofaríngea, així com en altres tipus cel·lulars. En el cervell humà, l’expressió d’ACE2 és molt baixa, encara que no és negligible en àrees com el tàlam o el plexe coroideu.
Pepe et al. partien de la hipòtesi que els nanotubs tuneladors (TNTs) podrien participar en una dispersió intercel·lular de SARS-CoV-2. Els TNTs són conductes prims i membranosos rics en actina. Funcionen com a autèntics ponts intercel·lulars i serveixen al transport d’orgànuls i de proteïnes. És sabut que alguns tipus de virus utilitzen TNTs per disperar-se en els teixits.
Pepe et al. utilitzen com a model cultius de la línia cel·lular Vero E6. Aquestes són cèl·lules epitelials d’origen renal que han estat a bastament emprades en investigacions sobre el SARS-CoV-2. Com a model neuronal han triat la línia cel·lular humana SH-SY5Y, i deixen per més endavant el treball amb cultius primaris de neurones humanes.
Les cèl·lules SH-SY5Y no són permissives a la infecció per SARS-CoV-2. No obstant, en co-cultivar-les amb cèl·lules Vero E6 prèviament infectades, sí es poden infectar a través d’un mecanisme mediat per TNTs.
Una ruta de dispersió del SARS-CoV-2 independent de l’endocitosi mediada per receptor
Pepe et al. cultivaren paral·lelament neurones humanes SH-SY5Y i neurones murines CAD amb SARS-CoV-2. Després de tres dies d’exposició, tenyien les monocapes dels cultius amb un anticòs específic de la proteïna N (nucleoproteïna) de SARS-CoV-2. Cap de les dues línies neuronals mostrava indicis d’infecció. Quan passa això diem que són línies cel·lulars no-permissives a la infecció per SARS-CoV-2.
Quan fan el mateix experiment amb les línies cel·lulars Vero E6 i Caco-2, el SARS-CoV-2 aconsegueix d’infectar els cultius. Diem que aquestes sí són línies cel·lulars permissives a la infecció per SARS-CoV-2.
La impermissivitat de les cèl·lules de SH-SY5Y a infectar-se per SARS-CoV-2 s’explica per la nul·la o extremadament baixa expressió d’ACE2.
Quan Pepe et al. co-cultiven cèl·lules Vero E6 infectades per SARS-CoV-2 amb cèl·lules SH-SY5Y marcades amb un plàsmid portador del gen mCherry, troben que al cap de 24 hores, el 36,4% de les neurones ja reaccionen amb l’anticòs anti-N. A 48 hores, aquest percentatge puja a 62,5%.
La immunotinció amb un anticòs anti-S de co-cultius confirma la infecció de SARS-CoV-2 de neurones: un 21,8% ja són positives a 24 hores i s’arriba a un 42,4% a 48 hores. En utilitzar simultàniament els anticossos anti-N i anti-S, hi ha una colocalització del senyal, indicativa de la presència de virions madurs dins de vesícules endocítiques de les neurones. Aquests virions poden ésser el resultat d’una transferència directa de les Vero E6, o producte d’una síntesi dins de les pròpies neurones.
Per conèixer si en els co-cultius, el SARS-CoV-2 és capaç de replicar en les cèl·lules neuronals. Pepe et al. empren un anticòs J2 anti-RNA-bicatenari. A 48 hores de co-cultiu, la immunotinció amb aquest anticòs indica la replicació activa del SARS-CoV-2 en neurones, possiblement en vesícules de doble membrana. La immunotinció dels co-cultius amb un anticòs anti-nsp3 indica que en les neurones hi ha presència efectiva de SARS-CoV-2.
Pepe et al. empren remdesivir com a inhibidor de la replicació viral. En cultius de Vero E6, una concentració de 30 μM de remdesivir és prou alta com per inhibir la producció de virus. En presència de remdesivir, la infecció de neurones co-cultivades queda força reduïda.
El rol dels TNTs en la transmissió de SARS-CoV-2
L’exposició de cèl·lules SH-SY5Y en monocultiu a sobrenedants de monocultius de cèl·lules Vero E6 infectades no indueix la infecció per SARS-CoV-2 en les neurones. En canvi, el sobrenedant de cultius infectats és capaç per ell mateix d’infectar nous monocultius de Vero E6.
Sembla doncs, que la infecció de les neurones requereix un contacte directa amb cèl·lules epitelials infectades. La microscòpia confocal permet identificar estructures de contacte intercel·lular. Moltes d’aquestes estructures es basen en el citoesquelet d’actina, com és el cas de fil·lopodis o dels túnels de nanotubs (TNTs). Mentre que els fil·lopodis són protrusions membranoses d’una cèl·lula que la posen en contacte amb les veïnes directes, els TNTs poden assolir llargades més considerables. Pepe et al. observen en co-cultius la formació de TNTs entre cèl·lules Vero E6 i SH-SY5Y.
L’ús d’anticossos contra components del SARS-CoV-2 (nsp3, S, N) indiquen que dins dels TNTs hi hauria complexos replicatius i virions madurs de SARS-CoV-2.
La infecció per SARS-CoV-2 promou una llargada superior de TNTs. Si en cèl·lules Vero E6 no infectades, els TNTs tenen una longitud mitjana de 8 μm, la infecció quadriplica aquesta xifra fins a 34 μm. Si en co-cultius no infectats el percentatge de TNTs que connecten els dos tipus cel·lulars és del 35%, en co-cultius infectats aquest percentatge s’enfila al 62%. La infecció per SARS-CoV-2 promou i/o estabilitza la formació de TNTs.
D’altra banda, en co-cultius infectats, Pepe et al. també detecten la presència de la proteïna N de SARS-CoV-2 en TNTs que connecten neurones. Així doncs, les neurones infectades poden infectar neurones que encara no s’havien infectat a través de cèl·lules epitelials.
El rol dels TNTs en la transmissió de SARS-CoV-2 entre cèl·lules epitelials
Pepe et al. estudien la transmissió de SARS-CoV-2 entre cèl·lules Vero E6 infectades i no-infectades (marcades aquestes darreres amb mCherry) quan se les co-cultiva amb un anticòs anti-S neutralitzant (C3 235). L’anticòs és capaç de frenar la transmissió, però no pas d’anul·lar-la: a 24 hores, el 42,9% de les cèl·lules marcades amb mCherry ja són infectades, i a 48 hores ho són el 64%. Sense l’anticòs, les xifres són, respectivament, del 95% i del 97%. Quan analitzen la infectivitat de sobrenedants, Pepe et al. troben que els cultius que han estat incubats amb l’anticòs neutralitzant no són pas infectius, tal com evidencien amb un assaig de formació de focus.
Això indica que, quan hi ha una presència d’anticòs neutralitzant que barra l’entrada endocítica del virus, el SARS-CoV-2 encara fa transmissió intercel·lular per un mecanisme de contacte.
En co-cultius de Vero E6 i de SH SY5Y, l’anticòs neutralitzant no té cap efecte per evitar que el virus sigui transmès a les neurones.
L’associació entre SARS-CoV-2 i TNTs
Pepe et al. utilitzen de manera correlativa tècniques d’imatge CLEM, cryo-EM i cryo-ET que ofereixen una resolució superior a la de la microscòpia de fluorescència. Amb aquesta major resolució es constata la interacció entre partícules de SARS-CoV-2 i TNTs. En TNTs s’observen partícules de 50 a 100 nm, que en els tomogrames són positives per a la proteïna S. També s’hi observen estructures vesiculars d’una mida semblant en TNTs que connecten cèl·lules infectades.
En cultius controls de cèl·lules SH-SY5Y, els TNTs consisteixen feixos de nanotubs individuals (iTNTs). Els TNTs que contacten cèl·lules Vero E6 i SH-SY5Y són tubs aïllats, rics en actina. És aquesta darrera tipologia de TNTs la que explota el SARS-CoV-2 en la transmissió intercel·lular.
TNTs i covid-19
Prèviament s’havia descrit el rol de TNTs en la transferència intercel·lular de genomes vírics com del virus de la grip, el virus de la immunodeficiència humana (HIV) o el virus de l’herpes símplex (HSV). Aquesta via de transmissió comporta una elusió del sistema immunitari, el qual s’adreça especialment a les formes extracel·lulars del virus (les partícules víriques o virions).
Els TNTs poden constituir una via ràpida de dispersió de virus. La dinàmica de formació i esvaïment de TNTs es fa en qüestió de 30-60 segons, a través de la ràpida polimerització i despolimerització de l’actina. En el transport a través de TNTs els virus poden aprofitar l’acció motora de les miosines MyoVa o MyoX.
Pepe et al. ens mostren que la infecció per SARS-CoV-2 promou la formació de TNTs, fa que siguin més llargs i que es formin amb més freqüència entre tipus cel·lulars diferents. Quelcom semblant s’havia descrit per l’HIV.
Investigacions prèvies havien indicat que el SARS-CoV-2 també estimular la formació de protrusions filopodials, a través d’una activació de la casein-cinasa II (CK2). Pepe et al. pensen que la CK2 potser també és al darrera de l’augment de TNTs: la CK2 potser fosforilaria MyoX i aquesta regularia positivament la polimerització d’actina. Conèixer si aquests mecanismes realment funcionen en el seu model és la tasca que es proposen Pepe et al. També tenen per davant esclarir la dinàmica de transmissió del SARS-CoV-2 a través del TNTs.
Lligams:
- Tunneling nanotubes provide a route for SARS-CoV-2 spreading. Anna Pepe, Stefano Pietropaoli, Matthijn Vos, Giovanna Barba-Spaeth, Chiara Zurzolo. Science Advances (2022).
Cap comentari:
Publica un comentari a l'entrada