La descoberta d’una família d’endoglicosidases corinebacterials específiques d’IgG

Enzimologia: El biòleg Diego E. Sastre, investigador a la Emory University School of Medicine, és l’autor primer i corresponsal d’un article a la revista Cell on se’ns presenta una família d’endoglicosidases corinebacterials, els membres de la qual tenen un potent eficàcia contra models animals de patologies mediades per IgG. Es tracta d’endo-β-N-acetilglucosaminidases (ENGases) que hidrolitzen específicament el glicà unit al residu 297 d’asparagina (Asn297) dels anticossos d’immunoglobulina G. Aquesta activitat enzimàtica ér extraordinàriament rara i, alhora, cobejada. El glicà d’As297 és el principal determinant molecular del reconeixement de les IgG per part del receptor FcγR. El receptor FcγR reconeix la part constant de les IgG i és important per a la majoria de les accions fisiològiques i patològiques associades als anticossos. Fins ara hom havia descrit ENGases específiques d’IgG com a proteïnes secretades per soques d’Streptococcus pyogenes: aquests enzims permeten l’estreptococ d’eludir la immunitat basada en anticossos. Val a dir que les IgG-ENGases d’S. pyogenes són proteïnes complexes integrades per diversos dominis. Sastre et al. volien trobar una IgG-ENGasa de domini únic, i per trobar-la bastiren una anàlisi in silico i amb tècniques d’espectrometria de masses. Així trobaren una família d’ENGases secretades per corinebacteris patogènics que, alhora que són de domini únic, també mostren una estricta especificitat per les IgG. Mitjançant cristal·lografia de raigs X i ressonància de plasmó de superfície, Sastre et al. mostren com el membre de la família més eficient des del punt de mira catalític reconeix alhora els components proteic i glicà de la IgG. En una sèrie de models in vivo mostren l’eficàcia d’aquesta ENGasa específica d’IgG en la mitigació de diverses patologies que depenen de funcions efectores mediades per FcγR, com són la depleció de limfòcits T i B, l’anèmia hemolítica autoimmune, l’empitjorament del dengue mediat per anticossos, etc. Sastre et al. creuen en el potencial d’aquesta ENGasa en el tractament i/o prevenció de malalties humanes mediades per IgG.

Sastre et al. han descobert una família d’endoglicosidades corinebacterials específiques de la IgG de domini únic. Aquestes endoglicosidases ataquen tant el component proteic com el component glucànic de la IgG humana. Sastre et al. han comprovat que un membre típic d’aquesta família, CU43, mitiga diversos models animals de patologia mediada per IgG. Actua de manera semblant a efgartigimod, però amb una efectivitat 4000 vegades superior.

Les ENGases

L’autor que fa de contacte en aquest treball és Eric J. Sundberg, professor de bioquímica a Emory. Posen a disposició de qui ho demani els plàsmids generats en aquest estudi. També han publicat a Protein Data Bank les dades d’estructura de proteïna. La recerca s’ha finançat amb aportacions del National Institute of Allergy and Infectious Diseases i del National Cancer Institute. Alguns dels autors recorden que han registrat una sol·licitud de patent sobre material que ara apareix en aquest article.

Les endo-β-N-acetylglucosaminidases o endoglicosidades (ENGases) cauen en la classificació enzimàtica EC 3.2.1.96. Catalitzen la hidròlisi del nucli de quitobiosa de glucans enllaçats amb asparagina en glucoconjugats. Les ENGases de la família GH18 són estructuralment variables, la quals cosa fa que diferents membre de la família disposin de mecanismes catalítics diferents i tinguin especificitat per diferents N-glicans. La immensa majoria reconeixen els substrats glucoproteics per mecanismes específics de glicà. Hi ha un petit grup, però, que hidrolitza específicament l’enllaç β-1,4 dels primers dos residus d’N-acetilglucosamina dels glicans units a la Asn297 de la regió constant (Fc o fracció cristal·litzable) dels anticossos immunoglobulines G (IgG). Aquests darrers són enzims rars, amb una especificitat per la IgG doble en el sentit que abasta tant el component glucànic com el proteic de la IgG. En són exemples els enzims streptococals EndoS i EndoS2. EndoS i EndoS2 són proteïnes multidomini, que compten amb un domini GH18 (amb l’activitat glucosidasa hidrolasa), un domini amb repetició rica en leucina (LRR), un domini híbrid Ig i un domini β-sandwich amb estructura en forma de V. EndoS té un pes molecular de 108 KDa i ataca exclusivament N-glicans de tipus complex. EndoS2 té un pes molecular de 92 kDa i ataca els tres tipus de N-glicans que podem trobar en IgG.

El glicà d’Asn297 és el principal determinant molecular que permet que el receptor FcγR reconegui els IgG. Bona part de les funcions mediades per anticossos depenen d’aquest reconeixement. Les IgG-ENGases fan que les IgG no puguin ser reconegudes per FcγR i que perdin bona part del seu efecte. EndoS i EndoS2 són proteïnes secretades per soques patogèniques d’Streptococcus pyogenes i que participen de l’evasió de la resposta immune adaptativa d’aquest bacteri. Si bé les ENGases són un factor de virulència, també hi ha estudis en models animals que mostren el seu potencial en el tractament de malalties autoimmunes.

Suárez et al. volien trobar una família d’ENGases de domini únic. Triaren com a gènere bacterià on cercar-les Corynebacterium. Corynebacterium és un gènere grampositiu com Streptococcus, però que pertany als actinobacteris i que pot adoptar morfologies diverses. Hom ha descrit 250 espècies de Corynebacterium, de les quals un 20% són patògenes. La més coneguda, C. diphteria és l’agent etiològic de la diftèria. Altres espècies patògenes són C. pseudotuberculosis, C. belfantii, C. rouxii, C. silvativum i C. ulcerans. Les sis espècies citades formen un clade a banda, caracteritzat per la presència dels gens tox, que codifiquen per l’exotoxina diftèrica. Aquests gens tox no tenen un origen bacterià, sinó viral. En efecte, són gens del genoma de corinbacteriòfags que indueixen infeccions lisogèniques en aquest clade complex C. diphteria.

C. pseudotuberculosis secreta una ENGasa de 40 kDa, denominada CP40, i que pot hidrolitzar N-glicans en anticossos IgG. CP40, de fet, ja és aprovada actualment com a vaccí en ovins contra la limfadenitis caseica (CLA).

Sobre aquesta pista, Sastre et al. fan una anàlisi de xarxa de similitud de seqüència i de predicció de plegament de proteïnes. Així han pogut identificar una família d’ENGases secretada per corinebacteris patogènics que tenen una especificitat estricta per a N-glicans d’IgG. Aquesta especificitat l’han demostrada amb tècniques de cromatografia líquida acoblada amb espectrometria de masses amb glucoproteïna intacta. Dels membres de la família el més eficient des del punt de mira catalític és CU43, una ENGasa de C. ulcerans. Sastre et al. han pogut determinar l’estructura de cristalls de CU43 i analitzar així les seves interaccions proteïna-glicà i proteïna-proteïna. Han aconseguit generar una proteïna de fusió amb Fc de CU43 i ha mostrat la seva eficàcia en diversos models animals de patologies mediades per IgG, concentrament en soques de ratolins que expressen un FcγR humanitzat. Com a referent empren el blocador de FcRn efgartigimod, fàrmac aprovat en el tractament de la miastènia gravis generalitzada. Fc-CU43 és 4000 vegades més efectiu que efgartigimod, la qual cosa obre la porta a la seva aplicació en el tractament i prevenció de malalties autoimmunitàries i en la prevenció del rebuig en transplantaments d’òrgans i teixits.

ENGases corinebacterials

L’anàlisi SSN partia del domini GH18 d’EndoS i EndoS2. El GH18 d’aquestes ENGases és un barril TIM (triosa-fosfat isomerasa). La base de dades incloïa tots els enzims amb domini GH18 que es troben anotats a la col·lecció de famílies de proteïnes Pfam. Això suposa més de 80.000 seqüències diferents. Amb un mínim de 60 punts de coincidència, EndoS i EndoS2 queden dins d’un clúster trilobulat de 381 seqüències, integrat per 161 nodes. Els tres lòbuls són 1) IgG-ENGases multidomini (39 nodes, incloent-hi EndoS i EndoS2); 2) ENGases de un o dos dominis sense especificitat aparent per les IgG; 3) CP40 i altres ENGases corinebacterials.

Dins d’aquest tercer lòbul hi ha sis nodes: 1) el de CP40; 2) el de CP258, una ENGasa de la soca 258 de C. pseudotuberculosis; 3) CM49, una ENGasa de C. mustelae; 4) CR39, una ENGasa de C. rouxii; 5) CD38, una ENGasa de C. diphteria; i 6) CU43, una ENGasa de C. ulcerans de 43 kDa.

CP40 és capaç de deglicosilar les IgG humanes, equines i ovines, però no pas les IgG bovines o caprines.

Amb una recerca BLAST sobre NCBI, Sastre et al troben quatre ENGases corinebacterials addicionals, CS43, CB44, CX35 i CD51.

CX35 és una ENGasa evolutivament més relacionada amb EndoS i EndoS2. Les altres ENGases corinebacterials identificades per Sastre et al. es corresponen a una família separada.

Mitjançant models AlphaFold, Sastre et al. detecten un patró característic del centre actiu de les ENGases corinebacterials. La majoria d’ENGases corinebacterials consisteixen en una proteïna d’un sol domini GH18, sovint acompanyat d’un motiu C-termini en forma de breu llaç o hèlix.

Especificitat estricta per N-glicans vinculats a la Asn297 d’IgG humans nadius

L’anàlisi LC-MS amb glucoproteïna intacta permet a Sastre et al. d’estudiar l’especificitat potencial de les ENGases corinebacterials. Per fer-ho les clonaren en vectors recombinants d’expressió i les purificaren. Les glucoproteïnes assajades foren: 1) IgG1 de longitud completa, amb un N-glicà CT; 2) IgG1-Fc amb un N-glicà remodelat en HM; 3) una RNAasaB amb N-glicà HM; 4) una transferrina amb N-glicà CT.

De les 10 ENGases assajades, set (CP40, CM49, CR39, CS43, CB44, CP258, i CU43) eren estrictament específiques d’IgG, preferentment amb N-glicans CT.

CU43 fou assajada amb N-glicans de les diferents classes d’anticossos humans (IgA, IgD, IgE, IgG i IgM) i de la fetuïna. Com a control positiu empraven la PNGasaF. L’anàlisi per SDS-PAGE confirmava que CU43 era estrictament específiques d’IgG.

Una anàlisi d’activitat enzimàtica amb diverses subclasses d’IgG humanes i murines demostrà que les IgG-ENGases corinebacterials són actives especialment amb les IgG1 i IgG2 humanes, però no amb les murines. L’assaig amb regions IgG1 Fc desnaturalitzades mostrava que el reconeixement es basa en la forma nadiua de l’anticòs. L’acció era específica dels glicans vinculats a Asn297.

L’anàlisi d’estabilitat termal a 52°C i 56°C només el superaren CU43 i CM49.

Pel que fa a la cinètica enzimàtica, CU43 era la més eficient.

El reconeixement de substrat de CU43

Sastre et al. aconseguiren cristal·litzar CU43i, una variant inactiva CU43 amb les mutacions D187A i E189A. L’anàlisi estructural mostrava un doble reconeixement de substrat per part del glicà i per la part proteica. L’anàlisi de ressonància de plasmó de superfície aclaria encara més els lloc d’interacció de CU43 amb la IgG.

La proteïna de fusió CU43-Fc prevé la depleció citotòxica de limfòcits T mediada per anticòs en un model de ratolí hFcγR

Els ratolins hFcγR expressen el receptor humà de Fc d’immunoglobulines. L’administració a aquests ratolins de l’anticòs monoclonal YTS191 indueix una depleció dels limfòcits T CD4+. La proteïna de fusió CU43-Fc pot impedir aquesta depleció en dosis de 0,1 μg. En aquest sentit resulta més efectiu que l’ efgartigimod.

La proteïna de fusió CU43-Fc prevé la depleció citotòxica de limfòcits B mediada per anticòs en un model de ratolí hFcγR

L’administració a aquests ratolins de l’anticòs monoclonal 2B8 indueix una depleció de limfòcits B. CU43-Fc és capaç de prevenir aquesta depleció.

La proteïna de fusió CU43-Fc prevé l’anèmia hemolítica autoimmune en un model de ratolí hFcγR

En un model de ratolins que expressen les formes humanes de CD47, SIRPa, i FcγRs es pot induir una anèmia hemolítica amb magrolimab. CU43-Fc pot alleugerir aquesta anèmica hemolítica reduint-hi la mortalitat.

La proteïna de fusió CU43-Fc prevé una forma agreujada de dengue en un model de ratolí hFcγR

En un model de ratolí hFcγR que és alhora knock-out per al gen de l’intereró de tipus I, la infecció amb el virus dengue DENV2 indueix una patologia en gran mesura mediada per la formació anticossos contra el virus més que no pas de l’acció directa del virus. CU43-Fc és capaç de prevenir aquest agreujament reduint la pèrdua de pes i la mortalitat.

Les perspectives de CU43

Actualment no hi ha una teràpia guaridora de les malalties autoimmunes. Els tractaments actuals cerquen una supressió global de l’activitat immune, com fan els corticoesteroides. L’efgartigimod és l’únic medicament que actua específicament contra la interacció IgG-FcR, i tan sols s’ha autoritzat en la miastènia gravis generalitzada. En alguns dels models animals d’aquest estudi CU43-Fc és 4000 vegades més actiu que l’efgartigimod. Això obre la porta a aplicacions en el tractament de malalties autoimmunes, en el tractament del rebuig de transplantaments d’òrgans sòlids, en les complicacions de malalties virals degudes a la generació d’anticossos, etc. Sastre et al. són conscients que això passa per un treball d’enginyeria enzimàtica enfocada a glicoformes i subclasses d’IgG.

Lligams:

- Potent efficacy of an IgG-specific endoglycosidase against IgG-mediated pathologies. Diego E. Sastre, Stylianos Bournazos, Jonathan Du, E. Josephine Boder, Julia E. Edgar, Tala Azzam, Nazneen Sultana, Maros Huliciak, Maria Flowers, Lea Yoza, Ting Xu, Tatiana A. Chernova, Jeffrey V. Ravetch, Eric J. Sundberg. Cell (2024).