diumenge, 14 de novembre de 2021

Què indiquen els microARNs del líquid cefalorraquidi de malalts de Parkinson?

Neurologia molecular: La malaltia de Parkinson és un trastorn neurodegeneratiu que afecta principalment el sistema motor (tremolors, rigidesa, lentitud de moviment, dificultat de caminar), però que també presenta símptomes no-motors (problemes cognitius i de comportament). La base neuronal de la malaltia de Parkinson és la mort selectiva de les neurones dopaminèrgiques de la pars compacta de la substantia nigra, un dels ganglis basals del mesencèfal. La formació de cossos de Lewy (LBs) és el tret histològic més característic. Aquests inclusions consisteixen en agregats d’alfa-sinucleïna, i en aquest sentit hom diu que la malaltia de Parkinson és una proteïnopatia (amb acumulació d’alfa-sinucleïna i de proteïna tau) i, més concretament, una alfa-sinucleopatia. Amb aquest coneixement, s’ha treballat en possibles dianes moleculars per al tractament del Parkinson. La recerca pre-clínica trobà que el nilotinib, un inhibidor de la Brc-Abl tirosin-kinasa desenvolupat per Novartis, té la capacitat de penetrar el cervell i promoure la degradació autofàgica d’alfa-sinucleïna i de p-tau. A partir del gener del 2017, Fernando Pagan, de la Georgetown University, liderà un assaig clínic aleatoritzat, a doble cec i amb control de placebo per avaluar l'impacte de dosis baixes de nilonitib en termes de seguretat, tolerabilitat, farmacocinètica i biomarcadors de la malaltia de Parkinson. En el líquid cefalorraquidi dels 75 participants d’aquest assaig, conclòs l’any passat, s’estudiaren els nivells de microARNs (miRNAs). Els resultats d’aquesta anàlisi apareixen ara en un article a la revista Neurology Genetics. Les puncions lumbars per obtindre el líquid cefalorraquidi es feren després de l’administració de dosis ascendents úniques aleatòries de nilonitib, en el benentès que alguns pacients no rebien gens de nilonitib, uns altres una dosi diària de 150 mg i uns tercers una dosi diària de 300 mg. Les dades longitudinals d’1 any indicaven canvis significatius en els nivells de miRNAs que controlen gens i vies de senyalització que regulen l’angiogènesi, l’autofàgia i components de la barrera hematoencefàlica (principalment, col·lagena). Els miRNAs, doncs, ens informen dels processos biològics que es troben afectats per la progressió del Parkinson. El nilonitib és capaç de contrarestar alguns d’aquests canvis dels miRNAs del fluid cerebrospinal, i aquests canvis es correlacionen amb la clínica dels participants. Ara bé, una dosi única de nilonitib no és capaç d’alterar els nivells cefalorraquidis de miRNAs. Potser el més sorprenent d’aquest estudi és constatar la rellevància de factors vasculars (angiogènesi i barrera hematoencefàlica) en el Parkinson. Els miRNAs expressarien canvis epigenòmics rellevants en la malaltia de Parkinson i és esperançador que el nilonitib sigui capaç de modificar-los en el decurs d’1 any de tractament.

La sobreactivació del DDR1 en la malaltia de Parkinson promou canvis epigenòmics que es manifesten en canvis en els nivells cerebrospinals de miRNAs com hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-7162-5p i hsa-miR-4252. Aquests miRNAs participen en la regulació de la barrera hematoencefàlica i en l’autofàgia, però al mateix temps reforcen la sobre activació de DDR1. El nilonitib actuaria inhibint el DDR1, i alteraria els nivells de miRNAs com hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-5195 i hsa-miR182-5p, millorant el manteniment de la barrera hematoencefàlica, el transport hematoencefàlic de glucosa i el flux autofàgic.

Els miRNAs cefalorraquidis com a biomarcadors de la malaltia de Parkinson

Charbel Moussa, professor associat de neurologia i director del Laboratory for Dementia and Parkinsonism de la Georgetown University, concebé l’estudi, el dissenyà, i redactà l’article que citem. Alan Fowler i Jaeil Ann investigadors de la Georgetown University, adquiriren i analitzaren dades, i redactaren l’article. Altres membres de la Georgetown University participaren en l’adquisició de dades: Michealine Hebron, Timothy L. Chiu, Reem Ayoub, Sanjana Mulki, Habtom W. Ressom, Yasar Torres-Yaghi, Barbara Wilmarth i Fernando Pagan.

La recerca es finançà amb fons de la Georgetown University assignats a Moussa, i amb donatius del Lasky and Barajas Family Fund i d’altres filantrops. Novartis facilità el nilonitib de l’assaig clínic.

Els autors declaren diferents conflictes d’interès. Torres-Yaghi treballa d’assessor. Moussa ha registrat diverses patents sobre l’ús del nilonitib i d’altres inhibidors de tirosin-cinases com a tractaments de malalties neurodegeneratives. El treball del laboratori de Moussa s’ha traduït en una start-up, KeifeRX.

L’article fou tramès a Neurology Genetics el 28 d’abril del 2021, i acceptat el 27 d’agost. Els autors tenen paraules d’agraïment per a les infermeres i resta del personal de la Clinical Research Unit del Georgetown University Medical Center, i del Center for Translational and Clinical Science, i pels membres de la Genomics and Epigenomics Shared Resource.

Els microàcids ribonucleics (miRNAs) regulen l’expressió gènica a través del silenciament d’ARN missatger (mRNA) i d’altres processos post-transcripcionals. El laboratori de Moussa, a través de la feina de Fowler, ha posat de manifest que les tècniques de seqüenciació de darrera generació permeten d’identificar en el líquid cefalorraquidi miRNAs que reflectirien la presència d’aquests reguladors en els teixits neurals. En pacients de Parkinson, hom troba alteracions en miRNAs que controlen gens associats amb la ubiqüitinilació i l’autofàgia.

L’autofàgia és un procés essencial per al manteniment dels teixits biològics. La ubiqüitina serveix de marcador per a la degradació de proteïnes. I la malaltia de Parkinson es pot descriure com una malaltia d’acumulació extracel·lular de proteïnes com l’alfa-sinucleïna i la tau, és a dir com una malaltia d’alteració de l’autofàgia. Les necròpsies cerebrals de malalts de Parkinson evidencien la rellevància d’aquests processos.

El laboratori de Moussa és especialment interessat en el rol de la tirosin-cinases en la malaltia de Parkinson i altres malalties neurodegeneratives. Les tirosin-cinases catalitzen la fosforilació específica de residus de tirosina d’altres proteïnes. Entre aquestes tirosin-cinases trobem els receptors de domini de discoidina (DDRs). Les necròpsies indiquen que en la malaltia de Parkinson hi ha una sobre activació de DDR1 i de DDR2 en el nigrostriatum (la zona de contacte entre la substantia nigra i el cos estriat). L’activació de la DDR1, a través de l’afectació de la col·lagena, altera l’activitat de la micròglia (les cèl·lules no-neuronals del teixit nerviós) i l’activitat de les metal·loproteases de matriu (que participen en la degradació de proteïnes extracel·lulars): això comporta una degradació de la barrera hematoencefàlica, la capa de cèl·lules endotelials que regula els bescanvis entre fluid extracel·lular del sistema nerviós central i el plasma sanguini. La deleció o la inhibició de la DDR1, en models pre-clínics, atenua la neuroinflamació, millora el transport vesicular del sistema nerviós i protegeix el procés autofàgic.

El nilonitib actuaria a través de la inhibició de la DDR1: nivells d’1 nM són ja capaços d’inhibir a la meitat l’activitat DDR1. Això es suficient per atenuar els canvis de miRNAs que regulen l’autofàgia. Un tractament diari de 150 mg de nilonitib es tradueix en una concentració en el líquid cefalorraquidi d’aquest fàrmac de 1,9 nM, i amb un tractament diària de 300 mg s’assoleix una concentració en el líquid cefalorraquidi d 4,12 nM.

Un assaig clínic amb 75 participants

Els pacients als quals s’adreçava aquest assaig eren malalts de Parkinson amb una situació moderadament severa estabilitzada amb la teràpia de suplementació de dopamina.

Els 75 participants eren distribuïts aleatòriament en cinc grups de 15:
- grup 0: que rebria un placebo.
- grup que rebria 150 mg de nilonitib.
- grup que rebria 200 mg de nilonitib.
- grup que rebria 300 mg de nilonitib.
- grup que rebria 400 mg de nilonitib.

Unes hores (1-4) després de l’administració, se’ls prenia mostres de líquid cefalorraquidi.

Després, els 75 participants eren distribuïts de nou aleatòriament en tres grups:
- un de 21, que rebria el placebo.
- un de 21, que rebria 150 mg diaris de nilonitib.
- un de 20 que rebria 300 mg diaris de nilonitib.

Aquesta fase de l’estudi durà 12 mesos, al cap dels quals es feia una extracció de líquid cefalorraquidi.

Després d’aquesta segona fase seguien 3 mesos de rentat (sense tractament), al cap dels quals 63 pacients entraren en la tercera fase, en la que rebrien 150 o 300 mg de nilonitib diaris durant 12 mesos addicionals.

El protocol de l’assaig fou aprovat pel Comitè Ètic del Georgetown-Howard Universities Center. Comptava amb un comitè independent de seguretat i monitorització integrat per un cardiòleg, un hematòleg, un farmacòleg clínic, un neuròleg i un biostatístic. Les mostres recollides eren desidentificades per tal d’anonimitzar-les.

Els participants havien de complir els criteris diagnòstics de Parkinson del UK Brain Bank, un nivell 2,5-3,0 de Hoehn-Yahr, una puntuació de 22 o superior de l’escala cognitiva de Montreal (MoCa), i una de 20-40 de la MDS-UPDRS-III. Els participants aportaven un consentiment escrit i, durant tot l’estudi mantenien el tractament de base amb levodopa (800 mg diaris) o de combinació de levodopa amb agonistes de dopamina. Les dades clíniques més rellevants eren les puntuacions MoCa, MDS-UPDRS i PDQ39 en la visita de base, a 12 mesos i a 27 mesos.

El líquid cefalorraquidi era recollit per punció lumbar. El primer mil·lilitre era descartat, i les mostres eren centrifugades abans d’aliquotar-se i congelar-se a -80ºC. Les mostres que contenien un nivell de hemoglobina superior a 25 ng/mL eren descartades, en considerar-les contaminades amb sang.

De les mostres de líquid cefalorraquidi es feia una extracció d’ARN total extracel·lular. S’hi feia una genoteca de miRNAs amb el kit corresponent de Qiagen, damunt de la qual es feia una seqüenciació per la plataforma d’Illumina.

Els nivells observats de miRNAs

En la primera fase de l’assaig es tractava d’avaluar si una sola dosi de nilonitib era capaç d’alterar els nivells cefalorraquidis de miRNAs en qüestió d’hores. Fowler et al. no observaren canvis en aquesta fase, tret dels nivells de hsa-miR-451a.

En la segona fase de l’assaig, Fowler et al. analitzaren els canvis induïts per un tractament diari amb nilonitib durant 12 mesos. En totes les mostres (0, 150 mg i 300 mg diaris de nilonitib) pogueren analitzar els nivells de 2559 miRNAs, corresponents pràcticament a tot el genoma humà de miRNAs.

Entre els miRNAs que s’hi veien augmentats en els grups tractats amb nilonitib hi havia hsa-miR-3918 (que inhibeix la tirosin-cinasa SRC) i hsa-miR-5195-3p (que inhibeix l’activitat DDR1). El nilonitib actua sobre la proteïna DDR1, promovent-ne la defosforilació: d’alguna manera poc coneguda aquesta acció sobre la proteïna alteraria l’expressió de hsa-miR-5195-3p.

En la malaltia de Parkinson es troben disminuïts els miRNAs hsa-miR-30b-5p (regulador de ATG12, ATG5 i BECN1) i hsa-miR-4252 (regulador de MAP1LC3C). ATG12, ATG5, BECN1 i MAP1LC3C són gens cabdals en el procés d’autofàgia i s’hi trobarien sobreexpressats en el Parkinson en un mecanisme compensatori. ATG5 i ATG12 participen en la construcció inicial dels autofagosomes, que tendeixen a acumular-se en la malaltia de Parkinson.

En la malaltia de Parkinson hi ha un augment de l’expressió cefalorraquídia de hsa-miR-3166, que és regulador de la LAMP-1, component de la membrana lisosomal. Això comportaria una reducció de l’activitat lisosomal, essencial per digerir les vacuoles autofàgiques.

En els pacients de Parkinson que rebien nilonitib es constata una reducció dels nivells de hsa-miR-15a-5p, miRNA inhibidor de gens reguladors de BLC2 i ATG9A. BCL2 i ATG9A participen en la maduració d’autofagosomes. El nilonitib també redueix l’expressió de hsa-miR-5195, miRNA inhibidor de LAMP-2. LAMP-2 participa en la maduració d’autofagosomes.

El tractament amb nilonitib durant 1 any, en disminuir els nivells de hsa-miR-15a-5p i hsa-miR-5195, restaura la funció de SQSTM1, SMURF2, FBXW7 i BTRC1, que participen en el reconeixement de substrats per a la degradació lisosomal. També hi ha una restauració de components que participen en la ubiqüitinilació: NEDD3, UBEs, MDM i PSMDs.

Fowler et al. troben també que la malaltia de Parkinson augmenta els nivells de hsa-30b-5p, hsa-miR-7162-5p, hsa-miR-4490 i hsa-miR-548as-5p: aquests miRNAs són reguladors de l’angiogènesi.

El mecanisme d’acció del nilonitib, en actuar a través de la senyalització del DDR1, tindria un seguit d’efectes en barrera hematoencefàlica, l’angiogènesi i la integritat vascular.

L’associació entre canvis de miRNAs cefalorraquidis i símptomes del Parkinson

Hi ha uns 15 miRNAs que presenten una correlació significativa amb l’escala UPDSR II + III. Entre aquests 15, hi ha hsa-miR-133b, que és regulador de la via angiogènica de VEGFR2.

Un total de 68 miRNAs es correlacionen significativament amb la puntuació clínica PDQ-39. Entre aquests trobem hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-520e, hsa-miR-134-5p i hsa-miR-378d, tots ells associats amb vies angiogèniques (proteoglicans, BNDF, TGF i VEGF).

Angiogènesi i autofàgia en la malaltia de Parkinson

Fowler et al. mostren, doncs, una associació entre la progressió de la malaltia de Parkinson i l’alteració dels nivells cefalorraquidis de miRNAs reguladors de la col·làgena, metal·loproteases extracel·lulars, angiogènesi, autofàgia i funció lisosomal. Això és especialment remarcable si atenem al fet que fins ara no s’havia constatat la participació de trastorns vasculars en la progressió del Parkinson.

Cal pensar, doncs, que en la malaltia de Parkinson seria rellevant l’activació de DDR1 per la unió amb col·làgena: aquesta activació no tan sols indueix inflamació en el sistema nerviós central sinó també un deteriorament de la barrera hematoencefàlica.

Fowler et al. pensen que la vascularització de la substantia nigra pot contribuir a una estabilització clínica. L’angiogènesi contribuiria a reduir els problemes associats a la toxicitat, la disfunció mitocondrial i l’acumulació d’agregats de proteïnes. En aquest sentit, el nilonitib actuaria doblement, pal·liant el dany vascular i la disfunció autofàgica de la malaltia de Parkinson. No obstant, Fowler et al. són conscients de la necessitat d’estudiar l’evolució dels miRNAs cerebrospinals en tots els estadis de la malaltia de Parkinson, amb grups de pacients més amplis i diversos.

Lligams:

- CSF MicroRNAs Reveal Impairment of Angiogenesis and Autophagy in Parkinson Disease. Alan J. Fowler, Jaeil Ahn, Michaeline Hebron, Timothy Chiu, Reem Ayoub, Sanjana Mulki, Habtom Ressom, Yasar Torres-Yaghi, Barbara Wilmarth, Fernando L. Pagan, Charbel Moussa. Neurology Genetics 7 (2021).

- Impact of Nilotinib on Safety, Tolerability, Pharmacokinetics and Biomarkers in Parkinson's Disease (PD Nilotinib).