Estructura i dinàmica de l’ExHOS en l’exocitosi constitutiva

Biologia cel·lular: El laboratori d’Oriol Gallego fa sobretot recerca en la dinàmica de membranes del llevat Saccharomyces cerevisiae, posant la biofísica al servei d’aquesta mena de processos de la biologia cel·lular. L’exocitosi constitutiva és el procés pel qual hi ha un tràfic de vesícules secretòries cap a la membrana citoplasmàtic, on, en fusionar-s’hi, aboquen el seu contingut al medi extracel·lular. La conducció de cada vesícula secretòria cap a la membrana plasmàtica va a càrrec d’un complex que rep el nom d’exocist. Això requereix l’existència d’una estructura superior que coordini l’acció dels diferents exocists. En un article acceptat a la revista Cell, amb Marta Puig-Tintó com a primera autora, s’explora aquesta estructura superior, coneguda per l’acrònim ExHOS. Puig-Tintó et al. integren resultats de microscòpia de super-resolució i de tomografia crioelectrònica en un model del paisatge conformacional continu de l’ExHOS, anotant-hi funcionalment les diferents conformacions. Set exocists formen un anell flexible de ExHOS que vehicula vesícules fins a menys de 45 nm de la membrana plasmàtica. Si l’ExHOS té un radi inicial de 19 nm, s’expandeix ràpidament fins empènyer la vesícula cap a la membrana plasmàtica. Segueix llavors una estabilització de l’ExHOS que posa la vesícula a 4 nm de la membrana plasmàtica. Després de produir-se la fusió de l’endomembrana vesicular i de la membrana plasmàtica, quan l’ExHOS té un radi de 38 nm, la proteïna Sec18 intervé en la desagregació de l’ExHOS.

Tomografia electrònica de Sasha Meek en la que es distingeixen un grup de vesícules esfèriques prop de la superfície cel·lular

L’ExHOS i l’exocist en l’exocitosi constitutiva

L’exocitosi constitutiva és el transport ininterromput de vesícules de secreció cap a la membrana citoplasmàtica, que culmina amb la fusió de la membrana vesicular amb ella, i l’abocament del contingut al medi extracel·lular. Aquest és un procés cel·lular essencial per a gairebé tots els organismes eucariòtics, ja que l’exocitosi juga un paper crític en l’homeostasi de membranes cel·lular, i en el creixement i divisió cel·lulars.

L’ancoratge de les vesícules de secreció a la membrana plasmàtica és un element central de l’exocitosi. És aquest ancoratge el que garanteix l’especificitat de la interacció entre les vesícules i la membrana plasmàtica.

El principal component de l’ancoratge és l’exocist, un complex proteic heterooctamèric. L’exocist interactua amb tot un ventall de proteïnes que participen en la regulació de l’exocitosi, com ara la Sec4 (una guanosin-trifosfatasa) o la Sec2 (un factor de bescanvi del guanilnucleòtid de la Sec4). La interacció de l’exocista amb la Sec9 (SNARE) condueix a la formació del complex exocític trans-SNARE, que juga un paper en la fusió de membranes. La fusió de membranes permet l’alliberament de la càrrega vesicular a l’espai extracel·lular. La Sec18 (una ATPasa) i la Sec17 participen llavors en la desagregació del complex SNARE, els components del qual seran reciclats en un nou procés d’ancoratge i fusió.

Experiments in vitro han ajudat a determinar que el complex d’ancoratge mesura 32 nm de llarg i 13 nm d’amplada. L’octàmer consisteix en dos mòduls tetramèrics:
- el mòdul I conté les subunitats Sec3, Sec5, Sec6 i Sec8.
- el mòdul II conté les subunitats Sec10, Sec15, Exo70 i Exo84.

La Sec15 interactua amb Sec4-Sec-2, mentre que l’extrem C-terminal de la Sec6 ho fa amb la Sec9.

L’ancoratge de cada vesícula individual depèn de la participació de diverses còpies de l’exocist. Aquesta estructura d’ordre superior rep el nom d’ExHOS.

Puig-Tintó et al. han bastit en S. cerevisiae un sistema de seguiment de partícules a dos colors de proteïnes exocítiques, que combinen amb microscòpia de super-resolució i microscòpia electrònica i òptica crio-correlativa.

La modelització de l’ancoratge a través del radi vesicular i el nombre de còpies d’exocist que hi participen

L’exocitosi consisteix en la interacció i transformació de membranes biològiques, concretament la de les vesícules secretòries i la de la membrana citoplasmàtica. Aquestes membranes consisteixen una bicapa lipídica, formada majoritàriament per fosfolípids, amb un gruix de 6-7 nm, en la qual trobem associades tot un ventall de glicoproteïnes.

Puig-Tintó et al. han treballat amb cèl·lules de llevat vitrificades, examinades per microscòpia electrònica d’escaneig per corrent iònic (FIB-SEM) i per tomografia crio-electrònica. Així poden de manifest l’ultrastructura tridimensional de les membranes. En les imatges han captat 175 vesícules adjacents a la membrana citoplasmàtic, en el sentit que s’hi trobaven a menys de 70 nm. Són vesícules esfèriques amb una radi mitjà de 41 ± 4 nm. Aquestes vesícules es troben preferencialment a una distància de la membrana citoplasmàtica de menys de 45 nm. Aquesta acumulació proximal seria vehiculada per un mecanisme que Puig-Tintó et al. atribueixen a un ancoratge mediat per exocist.

Per tal de determinar l’estequiometria dels exocists que participen en aquest ancoratge, Puig-Tintó et al. recorren a subunitats fusionades amb la proteïna fluorescent verda (GFP), de forma que les puguin seguir a través d’un assaig ratiomètric d’intensitat de fluorescència en llevats vius. Com a referència empren la Cse4-GFP. Troben que el nombre d’exocists presents en un esdeveniment d’exocitosi és de 7 ± 1, cosa que s’adiu amb el nombre de Sec3, Sec5, Sec6, Sec8 i Exo70 detectats en clústers d’exocists en una línia cel·lular de ratolí (NMuMG). L’estequiometria de cadascuna de les subunitat seria de 1 a 1.

Puig-Tintó et al. empren aquesta dada per modelitzar com un grup de 6 a 8 exocists pot ancorar vesícules de 41 nm de radi situades a diferents distància de la membrana citoplasmàtica. Cal que l’ExHOS que formen es pugui unir simultàniament a la vesícula i a la membrana citoplasmàtica. Assumeixen que cada exocist es pot representar com un cilindre de 13 nm de diàmetre i 32 nm d’altura. L’ExHOS es pot descriure per la localització radial de cada exocist respecte de l’eix central de la interfície vesícula-plasmalemma.

Un primer mecanisme possible seria que els 6-8 exocists que ancoren una vesícula adoptin conformacions heterotípiques, és a dir que es disposin de manera desigual entre la vesícula i el plasmalemma, amb unes distàncies d’entre 6,5 i 50 nm.

Un mecanisme alteratiu també plausible seria el d’una conformació homotípica de tots els exocists. Ací doncs, el radi d’ExHOS coincidiria amb la distància de casa exocist. El radi de l’anell ExHOS dependria del nombre de complexos que s’hi poden acomodar, així com de la distància d’ancoratge de la vesícula a la membrana citoplasmàtica. Un ExHOS format per 6 exocists que ancorés la vesícula a 34 nm de la membrana citoplasmàtic, tindria un radi de 15 nm. En canvi, si ho fes a 4 nm de la membrana citoplasmàtic, hauria de tindre un radi de fins a 50 nm.

Un ExHOS anular aportaria les forces laterals isotròpics necessàries per al desplaçament ortogonal de la vesícula cap a la membrana citoplasmàtic, és a dir per a l’apropament previ a la fusió de membranes.

Els exocists s’organitzaren en estructures anulars de radi variable

Puig-Tintó et al. empren la microscòpia de localització de molècula individual (SMLM) per estudiar in situ l’organització d’ExHOS. Aquesta microscòpia té una resolució de 20 nm. Treballen sobre llevats fixats que expressaven endògenament subunitats d’exocists del mòdul I (Sec5, Sec6 i Sec8) fusionades amb la proteïna fluorescent fotointerrumpible mMaple, i la subunitat Exo84 del mòdul II fusionada amb la GFP. Ajustant el plànol focal en el fons de les cèl·lules poden aconseguir projeccions bidimensionals d’agregats d’exocist-mM-GFP. Amb la correlació entre l’SMLM i la microscòpia de camp ample de difracció limitada (DL) poden segmentar 136 clústers d’exocist-mM-GFP. Estimen que cada clúster conté 5,8 ± 3,4 exocists.

En alguns dels clústers s’observen formes d’anell. Una reconstrucció sintètica de les imatges atenent a les dues possibilitats d’un ExHOS heterotípic (amb forma de clapa) o homotípic (amb forma d’anell), amb radis de 20-50 nm, indica que les imatges experimentals s’assemblen més a aquesta segona possibilitat.

Les dades de crio-ET, les prediccions computacionals i les imatges SMLM-DL indicarien, doncs, que vora 7 exocists de mitjana poden disposar-se en un ExHOS en forma d’anell que adopta radis diferents sobre la membrana citoplasmàstica. El que no queda clar és si aquesta distribució és estocàstica o hi ha un mecanisme dinàmic regular.

El dinamisme de la maquinària exocítica

Per a respondre aquesta qüestió, Puig-Tintó et al. examinen la correlació temporal dels clústers d’exocists amb altres proteïnes de la maquinària exocítica. Empren un assaig ratiomètric d’intensitat de fluorescència sobre llevats vius que expressen proteïnes de fusió com la Sec2-mNeonGreen (implicada en el transport de vesícules), la mNG-Sec9 (implicada en la fusió de vesícules) o la Sec18-mNG (implicada en el reciclatge de proteïnes). De mitjana, cada esdeveniment exocític consisteix en 8 ± 1 còpies de Sec2-mNG, 9 ± 1 còpies de mNG-Sec9 i 37 ± 5 còpies de Sec18-mNG. Això indicaria una estequiometria ∼1:1 entre l’exocist, la Sec2, la Sec9 i el complex Sec17-Sec18 (format per 4 còpies de Sec17 i 6 còpies de Sec18).

Les imatges sobre llevats vius tenen una resolució temporal de 115-120 ms quan es tracta de quantificar la dinàmica d’aquestes proteïnes marcades amb fluorescència. La microscòpia de difracció limitada de dos colors del pla equatorial de llevats que expressen Exo84-mCherry, Sec2-mNG, mNG-Sec9 o Sec18-mNG els permeté el seguiment de 90 esdeveniments exocítics. La vida mitjana d’un clúster d’exocist-mCh és de 9,4 ± 0,5 s. Més del 90% d’aquests clústers d’exocist-mCh colocalitzen amb clústers de marcadors de mNG. El 90% dels clústers de Sec2-mNG immobilitzats en la membrana citoplasmàtica coincideixen en temps i espai amb la detecció de clústers immòbils d’exocists-mCh.

En aquests experiments el senyal Sec2-mNG s’associa amb l’agregació d’exocists-mCh, en correspondència amb la iniciació de l’ancoratge. Llavors la SNARE mNG-Sec9 soluble s’incorporaria a l’esdeveniment exocític al cap de 3,1 ± 0,2 s. Al cap de 5,5 s ho farien Sec2-mNG i mNG-Sec9. L’alliberament de Sec2-nNG precedeix en 0,8 ± 0,6 s, la disgregació dels clústers d’exocists-mCh. El recrutament de Sec18-mNG té lloc 9,1 ± 0,5 s després de l’inici de l’ancoratge, de forma que hi ha una finestra de 0,3 segons de colocalització en l’exocist-mCh. Desagregats els clústers d’exocists-mCh, al cap de 2,5 ± 0,1 s desapareix el senyal mNG-Sec9, i al cap de 4,3 ± 0,1 s ho fa el de Sec18-mNG. Si comptem des de la biogènesis dels clústers estàtics d’exocist-mCh associats a la membrana citoplasmàtica fins a l’alliberament de la Sec18-mNG, el procés d’exocitosi tindria una durada mitjana de 13,7 ± 0,6 s. Sec2 participaria en els primers 8,6 segons. Sec9 ho faria des del segon 3,1 al segon 9,4. Sec18 ho faria del segon 9,1 al segon 9,4.

L’expansió radical de l’anell ExHOS durant l’exocitosi

El seguiment de la dinàmica estructural de l’ExHOS exigeix correlacionar les imatges puntuals de SMLM amb les imatges DL dels marcadors temporals Sec2-GFP i mNG-Sec9.

Els clústers d’exocists-mM que colocalitzen amb Sec2-GFP tenen una forma de clapa o pegat, amb un radi de 32 ± 2 nm.

Els clústers d’exocists-mM que colocalitzen amb mNG-Sec9 tenen una forma d’anell amb un radi de 37 ± 1 nm.

El model computacional d’un ExHOS que conté entre 6 i 8 exocists homotípics indica un radi que varia entre 15 i 22 nm en la fase compacta corresponent a l’ancoratge de la vesícula a 32-34 nm de la membrana citoplasmàtica. Després el radi fluctua entre 28 i 50 nm, en una fase expandida que situa la vesícula a 4 nm de la membrana citoplasmàtica.

Puig-Tintó et al. exploren si la transició estructural de la forma compacta a l’expandida segueix una cinètica de primer ordre. Si fos el cas, seguiria una taxa constant de 0,38 ± 0,06 s⁻¹. L’ExHOS començaria com un anell de 19 nm de radi per expandir-se radialment amb una semivida de 3 segons.

Sec18 participa en la dissociació de l’ExHOS estacionari i controla la iniciació de nous esdeveniments exocítics

En llevats als que s’indueix una depleció parcial de Sec18 marcada al domini FRB, hi ha una acumulació de mNG-Sec9 en els clústers, que augmenten la semivida en un factor de 2,5. Això comporta que el 94% ± 4% dels ExHOS d’aquestes cèl·lules siguin expandits, amb un radi de 38 ± 1 nm. Sec18, doncs, és requerida per a la desagregació de l’ExHOS.

Mitjançant la tècnica PICT és possible seguir en cèl·lules vives les interaccions proteïna-proteïna. En llevats que expressen Sec15-FRB i Sec18-mNG, s’evidencia que Sec18 interactua directament amb l’exocist.

L’espectrometria de masses acoblades a purificació per afinitat (AP-MS) indica que Exo84-GFP interactua amb totes les subunitats de l’exocist, i també amb Sec18.

Sec18 permetria, doncs, el reciclatge d’exocists per tal que puguin formar ExHOS en noves vesícules.

La ultraestructura de l’ancoratge i de la fusió

La microscòpia crio-electrònica (crio-CLEM) permet Puig-Tintó et al. de resoldre la ultraestructura de les membranes implicades en l’exocitosi constitutiva. Ho fan en llevats que expressen Sec5, Exo70 i Exo84 fusionades amb mNG.

A través de 95 clústers d’exocists-mNG retratats en tomogrames, Puig-Tintó et al. troben 76 casos amb correlació entre la presència d’una vesícula aïllada i el clúster.

En llevats que expressen Sec9 fusionada amb mScarlet3 (mSc3-Sec9) la crio-CLEM indica correlació entre vesícules aïllades i l’exocist. Aquestes vesícules es troben a menys de 7 nm de la membrana citoplasmàtica.

Les vesícules ancorades s’acumularien en tres estats metastables:
- MS1, amb un 15% de vesícules, se situaria a 27 ± 1,4 nm de la membrana citoplasmàtica.
- MS2, amb un 42% de vesícules, se situaria a 18 ± 2,8 nm de la membrana.
- MS3, amb un 38% de vesícules, se situaria a 5 ± 2,7 nm de distància.

Les vesícules durant l’ancoratge s’acostarien a la membrana citoplasmàtica en tres salts:
- el primer salt seria el més ràpid, i situaria la vesícula fins a 43 nm de la membrana citoplasmàtica, corresponent a l’estat MS1.
- el segon salt seria una aproximació més petita, corresponent a la transició de MS1 a MS2.
- el tercer salt seria el pas de MS2 a MS3. Al cap 7,5 segons de l’inici de l’ancoratge es produiria la fusió de la vesícula amb la membrana citoplasmàtica.

Un model de l’estructura i funcionament de l’ExHOS

L’ancoratge començaria en el moment que un clúster de 7 ± 1 exocists es disposa en un ExHOS de forma anular en un radi de 19 nm. Segueix una expansió radial de l’ExHOS que empeny ràpidament la vesícula cap a l’estat MS1 (a 27 nm de la membrana citoplasmàtica). Quan l’ExHOS arriba a 33 nm de radi, la vesícula passa a l’estat MS2 durant 2 segons. El pas a MS3 és propiciat per l’entrada de Sec9. Arribada la fusió de la vesícula, després d’un període de 1,9 segons comença la desagregació de l’ExHOS per la Sec18.

Esquema de la dinàmica estructural de l’ExHOS en l’exocitosi constitutiva del llevat

Lligams:

- Continuum architecture dynamics of vesicle tethering in exocytosis Marta Puig-Tintó, Sebastian Ortiz, Sasha Meek, Raffaele Coray, Altair C. Hernández, Anna Castellet, Eric Kramer, Laura I. Betancur, Philipp Hoess, Markus Mund, Mercè Izquierdo-Serra, Baldo Oliva, Alex de Marco, Jonas Ries, Daniel Castaño-Díez, Carlo Manzo, Oriol Gallego. Cell (2026).

- Descobreixen el nanomissatger que manté les cèl·lules en funcionament, notícia a la pàgina web de la Universitat Pompeu Fabra.