L’oligotrofització dels boscos boreals

Ecologia forestal: Kelley R. Bassett fa la tesi doctoral sobre canvis ambiental utilitzant dades de l’Inventari Nacional Suec de Boscos. En un article publicat aquesta setmana a la revista Nature, Basset et al. constaten que l’augment dels nivells atmosfèrics de diòxid de carboni (CO₂) en les darreres dècades ha reduït la disponibilitat nitrogen en els boscos boreals de Suècia. Seríem davant, doncs, d’un cas d’oligotrofització. És cert que les emissions antropogèniques de gasos amb efecte hivernacle, comporten una entrada neta de nitrogen a l’atmosfera, que contribueix a una eutrofització global. L’oligotrofització en els boscos boreals seria un contraexemple. Bassett et al. han reconstruït la cronologia de la proporció de nitrogen-15 (δ15N) en teixits vegetals representatius d’un àrea forestal sueca de 23,5 milions d’hectàrees en el període 1961-2018. Suècia és un país de contrastos latitudinals, i en un meridià de 1500 km trobem una variació en la deposició de nitrogen de l’ordre de quatre. En canvi, l’augment dels nivells atmosfèrics de CO₂ és latitudinalment uniforme. Per tot Suècia hi ha una davallada en la proporció de nitrogen-15, fins i tot en l’extrem nord, allà on la deposició de nitrogen atmosfèric és molt baixa. Els models lineals d’efectes mixtos indiquen que l’augment de CO₂ seria el principal predictor dels valors de δ15N, deixant enrere les variables de deposició de nitrogen, la temperatura o l’àrea basal forestal. Aquesta oligotrofització dels boscos boreals hauria d’ésser considerada quan modelem l’acció d’aquests ecosistemes com a embornals en el cicle global del carboni.

Bassett et al. han estudiat els patrons temporals de la proporció de nitrogen-15 i de la deposició de nitrogen en la fusta de Suècia

L’impacte de l’activitat humana en els cicles de carboni i nitrogen

El concepte original d’aquesta recerca fou formulat pel professor Michael Gundale, del Departament d’Ecologia i Gestió Forestal de la Universitat Sueca de Ciències Agrícoles, d’Umeå. Kelley R. Bassett, Gundale, Stefan F. Hupperts, Sandra Jämtgård, Jonas Fridman i Lars Östlund participaren en discussions sobre el disseny de l’estudi. Bassett gestionà tots els procediments d’arxiu i preparà les mostres per a l’anàlisi. Bassett realitzà totes les anàlisis estatístiques amb l’ajut de Hupperts en la gestió de dades i la programació en R. Bassett, Hupperts, Gundale, Jämtgård, Östlund i Steven S. Perakis analitzaren i interpretaren els resultats. Bassett redactà el primer esborrany de l’article, i tots els autors participaren en la discussió i revisió ulteriors.

Els autors agraeixen tot el personal de camp del NFI suec, del 1961 al 2018, la feina en la presa de mostres i recollida de dades. Agraeixen F. Johansson, M. Karlsson, T. Sundvall, P. Edlund i K. Spies l’ajut en els arxius. Agraeixen l’anàlisi de laboratori del Central Appalachians Stable Isotope Facility. A F. Maillard li agraeixen la revisió de l’article.

La recerca fou finançada amb la beca de Stiftelsen Gunnar och Birgitta Nordins fond (KSLA) a Bassett, i amb la de Brattås Stiftelsen, Troëdssons Stiftelsen, VR (2020-09308) a Gundale, i amb fons de la Fundació Wallenberg.

L’activitat humana té un impacte involuntari en forma de canvis ambientals, vehiculats en part per alteracions quantitatives en els cicles biogeoquímics del nitrogen i del carboni. Des del 1960, en especial, l’activitat humana ha decuplicat la taxa de creació de nitrogen reactiu (Nr). Això s’explica pel procés industrial de Haber-Bosch, per l’expansió de cultius lleguminosos i pel consum de combustibles fòssils. De fet, hom calcula que en el 2050 la creació de Nr s’haurà multiplicat per 18 des dels valors ‘pre-industrials’.

La producció humana global d’energia i aliments promou emissions de Nr, que resulten en la deposició de NHx i NOy en la superfície de la Terra. Això comporta un ‘enriquiment’ de N d’ecosistemes terrestres i aquàtics, que es tradueix en eutrofització i acidificació.

Més conegut encara és el fet que les activitats humanes han augmentat el nivell atmosfèric de CO₂ en més d’un 50% respecte dels valors preindustrials. Això comporta un estímul de la producció primària neta terrestre. En principi això no seria del tot negatiu, ja que els ecosistemes terrestres actuarien com a embornal de carboni. Ara bé, aquest augment de la productivitat primària neta interactua no tan sols amb el cicle del C sinó també el cicle del N, induint-hi una reducció de la disponibilitat de N. Això darrer conduiria a una limitació progressiva de N, és a dir a una oligotrofització d’ecosistemes terrestres. L’oligotrofització seria la conseqüència de l’estímul del CO₂ atmosfèric sobre el creixement vegetal i la captació de N: la disponibilitat de N en el sòl es veuria reduïda. Els teixits vegetals tendeixen llavors a augmentar la ratio C:N, la qual cosa estimula la immobilització de N microbià en el procés de descomposició detrítica. Tot plegat fa difícil preveure quina serà l’evolució del cicle del N en els diferents ecosistemes.

Disposar de sèries històriques de valors vegetals de δ15N pot ajudar a reconstruir la disponibilitat de nitrogen de diferents sòls i ecosistemes. Quan la disponibilitat de nitrogen és alta, els valors de δ15N són superiors. Això s’explica per la fraccionalització isotòpica entre el nitrogen-14 (majoritari) i el nitrogen-15 (nitrogen pesant) en processos ecosistèmics com la captació de nitrogen per les plantes, la volatilització d’amoni del sòl, la nitrificació, la lixiviació de nitrats o la desnitrificació. En boscos, el fongs micorrízics tendeixen a acumular nitrogen-15, i transfereixen als arbres una quantitat relativa superior de nitrogen-14.

Una cronologia de δ15N

Bassett et al. han analitzat els valors de δ15N de 1609 mostres de nuclis de fusta obtinguts d’arbres per perforació entre el 1961 i el 2018. La dendrocronologia d’aquests nuclis fa que el temps representat pels diferents anells vagi del 1950 al 2017. L’àrea forestal representada per aquestes mostres és de 23,5 milions d’hectàrees.

La variable que més els interessa és δ15N. Pensen que el %N de la fusta no seria un bon indicador de limitació de N, ja que els nivells de nitrogen de la fusta és, en general, massa baix.

Les determinacions isotòpiques es dugueren a terme al Central Appalachians Stable Isotope Facility (CASIF), a Frostburg, Maryland.

Les dades de temperatura mensual provenien de CRU TS v4.07. Les de CO₂ provenien de l’estació de Pallas-Sammaltunturi, a Finlàndia. Les dades de deposició de nitrogen provenien de ISIMIP3a.

Les mostres analitzades tenen un gradient latitudinal de 1500 km. En aquest gradient trobem diversos nivells de deposició de Nr: en l’actualitat a l’extrem meridional els valors de deposició són quatre vegades superiors als que trobem en l’extrem septentrional. Val a dir que les polítiques de reducció d’emissions ja han tingut un impacte a la Suècia meridional en els valors de deposició total de Nr i de NOy.

Les mostres de fusta analitzades corresponen a dues espècies: Picea abies (L.) H. Karst i Pinus sylvestris L. Els arbres pertanyien a classes d’edat similars (de 41 a 60 anys).

Bassett et al. dividiren Suècia en quatre regions: Nord, Central, Sud-Oriental i Sud-Occidental. Si al Nord la deposició de Nr és de ≤3 N kg ha⁻¹ any⁻¹, a la regió sud-occidental més industrialitzada fou de 12 N kg ha⁻¹ any⁻¹ en el pic de final dels anys 1990.

Els valors de δ15N tendien a davallar a un ritme anual entre −0,01‰ i −0,07‰.

Els factors darrera de la variació de δ15N

Bassett han construït models d’efectes mixtos lineals per comparar la capacitat explicativa de diferents variables: nivell atmosfèric de CO₂, deposició atmosfèrica de Nr, temperatura mitjana anual, canvi de temperatura i àrea basal total.

Els models indicaven que el CO₂ és el predictor més fort dels valors de δ15N. Per a P. sylvestris un augment d’1 ppm en la concentració atmosfèrica de CO₂ es tradueix en una davallada de δ15N de −0.04 ± 0.005‰. Per a P. abies, la davallada equivalent és menys marcada (−0.028 ± 0.005‰). Així doncs l’augment de CO₂ promou l’oligotrofització de l’ecosistema forestal boreal de Suècia. La diferència entre espècies podria explicar-se pel fet que P. sylvestris té una taxa superior en el recanvi d’acícules, la qual cosa fa que sigui inferior en termes d’eficiència d’ús de N.

Bassett no troben relació entre variables de deposició de Nr amb els valors de δ15N. Sí que hi ha una feble correlació positiva entre la deposició de N total i els valors de δ15N.

La correlació positiva entre la temperatura decadal o anual i els valors de δ15N podria atribuir-se al fet que una major temperatura ambiental accelera el cicle de nitrogen i la fraccionació isotòpica d’aquest element.

Les implicacions de l’oligotrofització dels boscos boreals

No és el primer estudi que troba un declivi en les cronologies de δ15N dels boscos boreals. Els resultats de Bassett et al. indiquen que el principal responsable d’aquest declivi és l’augment dels nivells atmosfèrics de CO₂.

Els boscos boreals tenen un paper important en el cicle global de C. Constitueixen un important reservori de C terrestre: si bé suposen tan sols el 17% de la superfície emergida, emmagatzemen el 32% del C terrestre.

L’augment dels nivells atmosfèrics de CO₂ estimula la fotosíntesi, el creixement i la demanda de N de les coníferes. L’acumulació superior de biomassa capta més N del sòl. D’altra banda, l’efecte ‘fertilitzant’ del CO₂ condueix a un augment de la ratio C:N en els teixits vegetals, de manera que la fullaraca també tindrà una ratio C:N més elevada, la qual cosa estimula la demanda N dels microorganismes descomponedors i també la immobilització de N per part de la microbiota del sòl.

Les dades forestals de Suècia indiquen que des dels anys 1950 hi ha hagut una tendència a l’augment de la biomassa de pins i avets a totes les regions. Ara bé, en les darreres dècades aquest augment comença a frenar-se possiblement per la disminució de disponibilitat de N i per una major exposició a sequeres i malalties.

En calcular el balanç de C del bosc boreal cal recordar que l’estoc de carboni dels sòls boreals és cinc vegades superior a l’estoc de carboni de la biomassa de les parts aèries de la vegetació. En qualsevol cas, la interferència en el cicle del N pot posar en perill el rol dels boscos boreals com a embornal en el cicle del C.

Lligams:

- Rising atmospheric CO2 reduces nitrogen availability in boreal forests. Kelley R. Bassett, Stefan F. Hupperts, Sandra Jämtgård, Lars Östlund, Jonas Fridman, Steven S. Perakis & Michael J. Gundale. Nature 650: 629-635 (2026).

- Riksskogstaxeringen, a la pàgina web de la Sveriges Lantbruksuniversitet.

El genoma de ‘Psychrobacter’ SC65A.3, un bacteri preservat en una cova de glaç de 5000 anys d’antiguitat

Bacteriologia: Anomenem ‘psicròfils’ als organismes adaptats a viure en ambients freds, com ara els que trobem en la criosfera. Encara que sembli impossible, en un ambient com el de la Cova de Glaç de Scărișoara, amb una antiguitat de 5000 anys, hom ha pogut isolar una soca bacteriana designada com a Psychrobacter sp. SC65A.3. En un article a Frontiers in Microbiology, Victoria Ioana Paun et al. reporten la seqüenciació genòmica completa i la caracterització funcional d’aquest bacteri. El més sorprenent és que aquest bacteri psicròfil antic mostra alhora un fenotip de resistència a fàrmacs antimicrobians moderns i una activitat contra altres microorganismes. Paun et al. han enfocat la llur anàlisi a la caracterització de l’extremotolerància (i no tan sols la tolerància al fred extrem), la susceptibilitat a antibiòtics i el perfil bioquímic. El bacteri SC65A.3 és un poliextremòfil. És psicròfil en el sentit que prefereix el fred, fins al punt que no pot créixer a una temperatura ambiental superior a 15 °C! És halòfil en el sentit que pot tolerar concentracions de clorur de sodi (NaCl) de 1,9 M (!) i de clorur de magnesi (MgCl₂) de 0,9 M. L’anàlisi filogenètica el situaria dins de l’espècie halopsicròfila P. cryohalolentis. Els assaigs funcionals mostren que aquest bacteri té una àmplia activitat hidrolítica i té la capacitat de resistir 10 antibiòtics de 8 classes diferents (cefalosporines de tercera generació, fluoroquinolones, aminoglucòsids i rifampicina). L’anàlisi de tot el seu genoma resultà en la identificació de més d’un centenar de gens associats a la resistència contra antimicrobians, com ara ampC, gyrA, gyrB, parC, parE, dfrA, rpoB, tetA, tetC o mcr-1. També presenta múltiples gens de resistència a metalls pesants i per a l’excreció de múltiples fàrmacs. Té gens per glucopèptids antimicrobians i per a la bacitracina, la qual cosa explica que tingui la capacitat d’inhibir 14 patògens del grup ESKAPE (MRSA, Enterococcus faecium, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae i Acinetobacter baumannii). També presenta 45 gens de resposta a l’estrès relacionats amb l’adaptació al fred, com ara htpX, htpG o pka. Aquest antic psicrobacteri té doncs un perfil dual de resistència a antimicrobians i d’activitat antimicrobiana. Aquest perfil encaixaria més en ambients on hi ha una biomassa i una activitat microbianes més considerable, però Paun et al. remarquen que les coves de glaç poden constituir un reservori de resistomes antics i de trets bioactius.

Fotografia de la Cova de Glaç de Scărișoara feta per V. I. Paun

Criosfera i microbis psicròfils

En aquesta recerca han participat Victoria Paun (del Departament de Microbiologia de l’Institut de Biologia de Bucarest de l’Acadèmia Romanesa), Corina Itcus (IB Bucarest), Paris Leonardo Lavin (Universidad de Antofagasta), Mariana Carmen Chifiriuc (Universitat de Bucarest) i Cristina Purcarea (IB Bucarest).

Vora el 20% de la superfície de la Terra és ocupada per hàbitats congelats. Una porció encara superior de la biosfera és exposada a baixes temperatures. Els microbis adaptats al fred poden explotar aquests hàbitats.

En l’actual context de canvi climàtic antropogènic accelerat, una part important de la criosfera es troba en recessió. Paun et al. ens recorden que els hàbitats glaçats serveixen de reservori de microorganismes psicrofílics, amb tot el que comporta en termes de diversitat genòmica i funcional. Els microorganismes psicrofílics tenen la capacitat de romandre estables i actius a temperatures baixes, una propietat que els fa d’interès en bio-nanotecnologia i en altres indústries. Són aquestes aplicacions les que esperonen el finançament de projectes de recerca sobre microbiomes en dipòsits perennes de glaç en coves. Aquests projectes treuen inspiració de tota la feina que s’ha anat realitzant en les darreres dècades sobre el microbioma del permafrost, el sòl permanentment glaçat, o de la plaques de gel polar, de la mar glaçada, de llacs glaçats o de neus.

La Cova de Glaç de Scărișoara, a Romania, és un exemple ben estudiat de cova de gel. Consisteix en un bloc de glaç perenne de 100.000 m³, amb una datació aproximada de 13.000 anys. En aquest dipòsit de glaç perenne hom ha pogut detectar una comunitat microbiana rica i complexa. La distribució d’aquesta comunitat dependria de les condicions climàtiques durant la formació del gel i del contingut de carboni orgànic dins del substrat del gel. El grup de Paun ha pogut isolar i caracteritzar tota una sèrie de soques bacterianes psicrotròfiques i psicrofíliques.

Pot semblar paradoxal que el grup de Paun sigui especialment interessat en la resistència a agents antimicrobians d’aquests bacteris psicròfils antics. Al capdavall, associem els agents antimicrobians a la clínica moderna, a l’ús de la penicil·lina i altres antibiòtics des de fa poc més de vuitanta anys. Però cal no oblidar que els antibiòtics foren descoberts a la natura i és lògic doncs que la resistència als antibiòtics sigui també un fenomen antic i natural. Durant milions d’anys hi ha hagut una coevolució entre els processos de síntesi d’antibiòtics per fongs i bacteris, i els mecanismes de resistència (alteració, control d’entrada i de sortida, inactivació enzimàtica, etc.).

Quan diem que els microorganismes resistents són un fenomen emergent, en realitat volem dir que l’ús clínic massiu d’antibiòtics ha suposat una pressió selectiva enorme en favor de la proliferació dels gens preexistents de resistència a antibiòtics. No és tan sols que aquesta pressió selectiva faci proliferar els microorganismes que en són portadors, sinó que també promou indirectament la transferència horitzontal d’aquests gens. S’ha establert una cursa entre la introducció de nous antibiòtics en medicina i veterinària i la resistència antimicrobiana. En afluixar la primera, la segona esdevé una crisi global en termes de medicina humana i veterinària, de seguretat alimentària i de salut ambiental.

Els ambients de permafrost poden constituir reservoris d’antics mecanismes de resistència. Com passa en els ambients extrems, hi ha una notable diversitat metabòlica. Alguns grups de recerca s’esforcen en trobar-hi nous agents antimicrobians, però també nous compostos antitumorals.

La Cova de Glaç de Scărișoara acull el bloc de glaç més gran i més antic conegut del subsòl. L’antiguitat del gel que l’integra segueix una cronoseqüència que puja fins a 13.000 anys d’antiguitat.

Entre els microorganismes que acull n’hi ha del gènere Psychrobacter. Aquest gènere fou descrit en el 1986 amb l’espècie tipus P. immobilis, situat en la família de les Moraxellaceae dins de la classe de les Gammaproteobacteria. Aquest gènere hauria evolucionat d’ancestres mesofílics adquirint una adaptació a ambients freds i salins. Actualment es coneix mig centenar d’espècie de Psychrobacter. Són bacteris de tinció Gram variable, amb morfologia de cocobacil, sense motilitat, i que formen colònies de color crema o taronja. Encara que prefereixen temperatures baixes i salinitat fortes, algunes soques poden tolerar temperatures de fins a 37 °C i salinitats baixes. Són bacteris estrictament aerobis, amb activitat catalasa i oxidasa. Poden utilitzar com a fonts de carboni una diversitat d’aminoàcids i d’àcids orgànics, però no són gaire versàtils bioquímicament. Algunes espècies (P. sanguinis, P. arenosus, P. faecalis, P. pulmonis and P. phenylpyruvicus) han estat descrites en infeccions oportunistes humanes, i d’altres (P. immobilis, P. glacincola) en peixos. L’interès biotecnològic d’aquest gènere se centra en els seus enzims actius sota el fred, com ara anhidrases carbòniques amb aplicacions en bioremediació, o com els implicats en la biosíntesi de terpenoides o la degradació de benzoats, la detoxificació de mercuri o la resistència a toxines.

Paun et al. ens parlen en aquest estudi d’una soca isolada d’una zona de la Cova de Glaç de Scărișoara de 5000 d’antiguitat.

Isolament, identificació i caracterització

La soca bacteriana Psychrobacter SC65A.3 fou isolada de glaç d’una antiguitat de 5.000 anys que fa part del nucli de glaç de 25,33 metres extret de la Cova de Scărișoara. L’isolament es va fer a 4 °C en un medi de cultiu R2B.

En medi sòlid TSA la soca fou incubada durant 14 dies a diverses temperatures (4 °C-37 °C). En medi LB sota agitació a 15 °C la soca fou incubada en diferents concentracions de NaCl (0-4 M) and MgCl₂ (0–4 M).

L’ADN genòmic fou isolat en un kit de Qiagen. Mitjançant la seqüenciació del gen 16S rRNA se’n va fer la identificació.

La susceptibilitat a antimicrobians fou assajada pel mètode de Kirby-Bauer, tenint en compte 28 antibiòtics de 17 classes diferents.

L’activitat antimicrobiana fou assajada per un mètode de difusió modificada sobre dues soques de referència i 20 soques patògens clínic isolades de la Col·lecció de la Universitat de Bucarest.

La caracterització bioquímica es va fer amb les tires API ZYM i API 20NE de BioMérieux a 15 °C.

La seqüenciació genòmica completa es va realitzar a Macrogen, a Corea del Sud.

Les anàlisis filogenètiques dels gens 16S rRNA i gyrB es van fer a la plataforma www.phylogeny.fr.

Característiques generals

A una alçada de 1706–1716 cm, el gel del nucli utilitzat té una antiguitat de 5335 ± 54 anys. El cultiu d’una mostra d’aquest gel en medi R2A a 4 °C donà lloc a una colònia amb una pigmentació entre taronja i rosa. La colònia fou seleccionada i purificada. Identificada amb el codi SC65A.3 podia créixer en medis R2A, TSA, MH i LB. En TSA, la soca podia créixer en temperatures entre 4 °C i 15 °C. A 15 °C en medi LB podia tolerar salinitats de fins a 1,9 M NaCl and 0,9 M MgCl₂.

L’anàlisi per BLAST situava la soca SC65A.3 en el gènere Psychrobacter.

Caracterització funcional

L’anàlisi en el sistema API ZYM mostrava una producció notable de lipasa C14, de fosfatasa alcalina, lipasa esterasa C 8 i de naftol-AS-BI-fosfohidrolasa.

L’anàlisi en el sistema API 20NE mostrava la presència de reducció de nitrat, d’hidròlisi d’urea, assimilació de citrat o de β-glucosidasa.

Dels 28 antibiòtics assajats, la soca era resistent a clindamicina, lincomicina, vancomicina o metronidazol. Això correspondria a un fenotip multiresistent.

Pel que fa a l’activitat antimicrobiana contra 22 patògens, la soca mostrava activitat contra 12.

El genoma

El genoma de SC65A.3 seria de 3.046.103 bases, amb un GC del 42,52%. Contenia 2536 gens codificants de proteïna, 15 gens d’ARNr i 50 gens d’ARNt. En aquesta llista trobem un locus CRISPR i 2 gens de resistència a antibiòtics.

L’anàlisi filogenètica situaria SC65A.3 dins de Psychrobacter cryohalolentis.

El genoma contindria 45 gens associats a l’adaptació termal, dels quals 29 amb processos de xoc tèrmic, i 16 de resposta al xoc per fred. D’aquests 45 gens, 21 corresponen a xaperones implicades en modificacions post-traduccionals i recanvi proteic.

El genoma contindria 107 gens associats a la resistència a antimicrobians. Hi trobem gens de beta-lactamases, gens resistència a tetraciclina, a fluoroquinolones, aminoglucòsids, etc.

El genoma contindria 11 gens potencialment implicats en l’activitat antimicrobiana. Entre les substàncies antimicrobianes detectades hi hauria la sublancina, la picromicina, la butirosina, la rebecamicina, la bacitracina, etc.

La potencialitat biotecnològica d’un poliextremòfil

SC65A.3 és un poliextremòfil que hauria romàs atrapat en el gel durant 5000 anys. Combinaria la psicrofília amb una halofília moderada. La psicrofília el fa especialment interessant pel que fa als seus enzims i proteïnes actives, amb aplicacions en biotecnologia, farmàcia i processos ambientals.

Però allò més interessant és la combinació d’una bona capacitat de resistència a antimicrobians i la producció d’un ventall de substàncies antimicrobianes. Aquest és un perfil típic de bacteris competitius, que han de posar ratlla al creixement de competidors, i alhora resistir la producció de toxines que aquests generen. Així disposa de tot un mecanisme afavoridor de l’excreció de toxines.

Paun et al. recorden la importància de monitoritzar els hàbitats naturals com a font de gens de resistència a agents antimicrobians. La idea que el desglaç pugui alliberar microorganismes perillosos per a la salut humana, animal o ambiental no és pura literatura de terror.

Lligams:

- First genome sequence and functional profiling of Psychrobacter SC65A.3 preserved in 5,000-year-old cave ice: insights into ancient resistome, antimicrobial potential, and enzymatic activities. Victoria Ioana Paun, Corina Itcus, Paris Lavin, Mariana Carmen Chifiriuc, Cristina Purcarea. Front. Microbiol. (2026).

- Bacteria frozen in ancient underground ice cave found to be resistant against 10 modern antibiotics. Deborah Pirchner. Frontiers News.

Estructura i dinàmica de l’ExHOS en l’exocitosi constitutiva

Biologia cel·lular: El laboratori d’Oriol Gallego fa sobretot recerca en la dinàmica de membranes del llevat Saccharomyces cerevisiae, posant la biofísica al servei d’aquesta mena de processos de la biologia cel·lular. L’exocitosi constitutiva és el procés pel qual hi ha un tràfic de vesícules secretòries cap a la membrana citoplasmàtic, on, en fusionar-s’hi, aboquen el seu contingut al medi extracel·lular. La conducció de cada vesícula secretòria cap a la membrana plasmàtica va a càrrec d’un complex que rep el nom d’exocist. Això requereix l’existència d’una estructura superior que coordini l’acció dels diferents exocists. En un article acceptat a la revista Cell, amb Marta Puig-Tintó com a primera autora, s’explora aquesta estructura superior, coneguda per l’acrònim ExHOS. Puig-Tintó et al. integren resultats de microscòpia de super-resolució i de tomografia crioelectrònica en un model del paisatge conformacional continu de l’ExHOS, anotant-hi funcionalment les diferents conformacions. Set exocists formen un anell flexible de ExHOS que vehicula vesícules fins a menys de 45 nm de la membrana plasmàtica. Si l’ExHOS té un radi inicial de 19 nm, s’expandeix ràpidament fins empènyer la vesícula cap a la membrana plasmàtica. Segueix llavors una estabilització de l’ExHOS que posa la vesícula a 4 nm de la membrana plasmàtica. Després de produir-se la fusió de l’endomembrana vesicular i de la membrana plasmàtica, quan l’ExHOS té un radi de 38 nm, la proteïna Sec18 intervé en la desagregació de l’ExHOS.

Tomografia electrònica de Sasha Meek en la que es distingeixen un grup de vesícules esfèriques prop de la superfície cel·lular

L’ExHOS i l’exocist en l’exocitosi constitutiva

L’exocitosi constitutiva és el transport ininterromput de vesícules de secreció cap a la membrana citoplasmàtica, que culmina amb la fusió de la membrana vesicular amb ella, i l’abocament del contingut al medi extracel·lular. Aquest és un procés cel·lular essencial per a gairebé tots els organismes eucariòtics, ja que l’exocitosi juga un paper crític en l’homeostasi de membranes cel·lular, i en el creixement i divisió cel·lulars.

L’ancoratge de les vesícules de secreció a la membrana plasmàtica és un element central de l’exocitosi. És aquest ancoratge el que garanteix l’especificitat de la interacció entre les vesícules i la membrana plasmàtica.

El principal component de l’ancoratge és l’exocist, un complex proteic heterooctamèric. L’exocist interactua amb tot un ventall de proteïnes que participen en la regulació de l’exocitosi, com ara la Sec4 (una guanosin-trifosfatasa) o la Sec2 (un factor de bescanvi del guanilnucleòtid de la Sec4). La interacció de l’exocista amb la Sec9 (SNARE) condueix a la formació del complex exocític trans-SNARE, que juga un paper en la fusió de membranes. La fusió de membranes permet l’alliberament de la càrrega vesicular a l’espai extracel·lular. La Sec18 (una ATPasa) i la Sec17 participen llavors en la desagregació del complex SNARE, els components del qual seran reciclats en un nou procés d’ancoratge i fusió.

Experiments in vitro han ajudat a determinar que el complex d’ancoratge mesura 32 nm de llarg i 13 nm d’amplada. L’octàmer consisteix en dos mòduls tetramèrics:
- el mòdul I conté les subunitats Sec3, Sec5, Sec6 i Sec8.
- el mòdul II conté les subunitats Sec10, Sec15, Exo70 i Exo84.

La Sec15 interactua amb Sec4-Sec-2, mentre que l’extrem C-terminal de la Sec6 ho fa amb la Sec9.

L’ancoratge de cada vesícula individual depèn de la participació de diverses còpies de l’exocist. Aquesta estructura d’ordre superior rep el nom d’ExHOS.

Puig-Tintó et al. han bastit en S. cerevisiae un sistema de seguiment de partícules a dos colors de proteïnes exocítiques, que combinen amb microscòpia de super-resolució i microscòpia electrònica i òptica crio-correlativa.

La modelització de l’ancoratge a través del radi vesicular i el nombre de còpies d’exocist que hi participen

L’exocitosi consisteix en la interacció i transformació de membranes biològiques, concretament la de les vesícules secretòries i la de la membrana citoplasmàtica. Aquestes membranes consisteixen una bicapa lipídica, formada majoritàriament per fosfolípids, amb un gruix de 6-7 nm, en la qual trobem associades tot un ventall de glicoproteïnes.

Puig-Tintó et al. han treballat amb cèl·lules de llevat vitrificades, examinades per microscòpia electrònica d’escaneig per corrent iònic (FIB-SEM) i per tomografia crio-electrònica. Així poden de manifest l’ultrastructura tridimensional de les membranes. En les imatges han captat 175 vesícules adjacents a la membrana citoplasmàtic, en el sentit que s’hi trobaven a menys de 70 nm. Són vesícules esfèriques amb una radi mitjà de 41 ± 4 nm. Aquestes vesícules es troben preferencialment a una distància de la membrana citoplasmàtica de menys de 45 nm. Aquesta acumulació proximal seria vehiculada per un mecanisme que Puig-Tintó et al. atribueixen a un ancoratge mediat per exocist.

Per tal de determinar l’estequiometria dels exocists que participen en aquest ancoratge, Puig-Tintó et al. recorren a subunitats fusionades amb la proteïna fluorescent verda (GFP), de forma que les puguin seguir a través d’un assaig ratiomètric d’intensitat de fluorescència en llevats vius. Com a referència empren la Cse4-GFP. Troben que el nombre d’exocists presents en un esdeveniment d’exocitosi és de 7 ± 1, cosa que s’adiu amb el nombre de Sec3, Sec5, Sec6, Sec8 i Exo70 detectats en clústers d’exocists en una línia cel·lular de ratolí (NMuMG). L’estequiometria de cadascuna de les subunitat seria de 1 a 1.

Puig-Tintó et al. empren aquesta dada per modelitzar com un grup de 6 a 8 exocists pot ancorar vesícules de 41 nm de radi situades a diferents distància de la membrana citoplasmàtica. Cal que l’ExHOS que formen es pugui unir simultàniament a la vesícula i a la membrana citoplasmàtica. Assumeixen que cada exocist es pot representar com un cilindre de 13 nm de diàmetre i 32 nm d’altura. L’ExHOS es pot descriure per la localització radial de cada exocist respecte de l’eix central de la interfície vesícula-plasmalemma.

Un primer mecanisme possible seria que els 6-8 exocists que ancoren una vesícula adoptin conformacions heterotípiques, és a dir que es disposin de manera desigual entre la vesícula i el plasmalemma, amb unes distàncies d’entre 6,5 i 50 nm.

Un mecanisme alteratiu també plausible seria el d’una conformació homotípica de tots els exocists. Ací doncs, el radi d’ExHOS coincidiria amb la distància de casa exocist. El radi de l’anell ExHOS dependria del nombre de complexos que s’hi poden acomodar, així com de la distància d’ancoratge de la vesícula a la membrana citoplasmàtica. Un ExHOS format per 6 exocists que ancorés la vesícula a 34 nm de la membrana citoplasmàtic, tindria un radi de 15 nm. En canvi, si ho fes a 4 nm de la membrana citoplasmàtic, hauria de tindre un radi de fins a 50 nm.

Un ExHOS anular aportaria les forces laterals isotròpics necessàries per al desplaçament ortogonal de la vesícula cap a la membrana citoplasmàtic, és a dir per a l’apropament previ a la fusió de membranes.

Els exocists s’organitzaren en estructures anulars de radi variable

Puig-Tintó et al. empren la microscòpia de localització de molècula individual (SMLM) per estudiar in situ l’organització d’ExHOS. Aquesta microscòpia té una resolució de 20 nm. Treballen sobre llevats fixats que expressaven endògenament subunitats d’exocists del mòdul I (Sec5, Sec6 i Sec8) fusionades amb la proteïna fluorescent fotointerrumpible mMaple, i la subunitat Exo84 del mòdul II fusionada amb la GFP. Ajustant el plànol focal en el fons de les cèl·lules poden aconseguir projeccions bidimensionals d’agregats d’exocist-mM-GFP. Amb la correlació entre l’SMLM i la microscòpia de camp ample de difracció limitada (DL) poden segmentar 136 clústers d’exocist-mM-GFP. Estimen que cada clúster conté 5,8 ± 3,4 exocists.

En alguns dels clústers s’observen formes d’anell. Una reconstrucció sintètica de les imatges atenent a les dues possibilitats d’un ExHOS heterotípic (amb forma de clapa) o homotípic (amb forma d’anell), amb radis de 20-50 nm, indica que les imatges experimentals s’assemblen més a aquesta segona possibilitat.

Les dades de crio-ET, les prediccions computacionals i les imatges SMLM-DL indicarien, doncs, que vora 7 exocists de mitjana poden disposar-se en un ExHOS en forma d’anell que adopta radis diferents sobre la membrana citoplasmàstica. El que no queda clar és si aquesta distribució és estocàstica o hi ha un mecanisme dinàmic regular.

El dinamisme de la maquinària exocítica

Per a respondre aquesta qüestió, Puig-Tintó et al. examinen la correlació temporal dels clústers d’exocists amb altres proteïnes de la maquinària exocítica. Empren un assaig ratiomètric d’intensitat de fluorescència sobre llevats vius que expressen proteïnes de fusió com la Sec2-mNeonGreen (implicada en el transport de vesícules), la mNG-Sec9 (implicada en la fusió de vesícules) o la Sec18-mNG (implicada en el reciclatge de proteïnes). De mitjana, cada esdeveniment exocític consisteix en 8 ± 1 còpies de Sec2-mNG, 9 ± 1 còpies de mNG-Sec9 i 37 ± 5 còpies de Sec18-mNG. Això indicaria una estequiometria ∼1:1 entre l’exocist, la Sec2, la Sec9 i el complex Sec17-Sec18 (format per 4 còpies de Sec17 i 6 còpies de Sec18).

Les imatges sobre llevats vius tenen una resolució temporal de 115-120 ms quan es tracta de quantificar la dinàmica d’aquestes proteïnes marcades amb fluorescència. La microscòpia de difracció limitada de dos colors del pla equatorial de llevats que expressen Exo84-mCherry, Sec2-mNG, mNG-Sec9 o Sec18-mNG els permeté el seguiment de 90 esdeveniments exocítics. La vida mitjana d’un clúster d’exocist-mCh és de 9,4 ± 0,5 s. Més del 90% d’aquests clústers d’exocist-mCh colocalitzen amb clústers de marcadors de mNG. El 90% dels clústers de Sec2-mNG immobilitzats en la membrana citoplasmàtica coincideixen en temps i espai amb la detecció de clústers immòbils d’exocists-mCh.

En aquests experiments el senyal Sec2-mNG s’associa amb l’agregació d’exocists-mCh, en correspondència amb la iniciació de l’ancoratge. Llavors la SNARE mNG-Sec9 soluble s’incorporaria a l’esdeveniment exocític al cap de 3,1 ± 0,2 s. Al cap de 5,5 s ho farien Sec2-mNG i mNG-Sec9. L’alliberament de Sec2-nNG precedeix en 0,8 ± 0,6 s, la disgregació dels clústers d’exocists-mCh. El recrutament de Sec18-mNG té lloc 9,1 ± 0,5 s després de l’inici de l’ancoratge, de forma que hi ha una finestra de 0,3 segons de colocalització en l’exocist-mCh. Desagregats els clústers d’exocists-mCh, al cap de 2,5 ± 0,1 s desapareix el senyal mNG-Sec9, i al cap de 4,3 ± 0,1 s ho fa el de Sec18-mNG. Si comptem des de la biogènesis dels clústers estàtics d’exocist-mCh associats a la membrana citoplasmàtica fins a l’alliberament de la Sec18-mNG, el procés d’exocitosi tindria una durada mitjana de 13,7 ± 0,6 s. Sec2 participaria en els primers 8,6 segons. Sec9 ho faria des del segon 3,1 al segon 9,4. Sec18 ho faria del segon 9,1 al segon 9,4.

L’expansió radical de l’anell ExHOS durant l’exocitosi

El seguiment de la dinàmica estructural de l’ExHOS exigeix correlacionar les imatges puntuals de SMLM amb les imatges DL dels marcadors temporals Sec2-GFP i mNG-Sec9.

Els clústers d’exocists-mM que colocalitzen amb Sec2-GFP tenen una forma de clapa o pegat, amb un radi de 32 ± 2 nm.

Els clústers d’exocists-mM que colocalitzen amb mNG-Sec9 tenen una forma d’anell amb un radi de 37 ± 1 nm.

El model computacional d’un ExHOS que conté entre 6 i 8 exocists homotípics indica un radi que varia entre 15 i 22 nm en la fase compacta corresponent a l’ancoratge de la vesícula a 32-34 nm de la membrana citoplasmàtica. Després el radi fluctua entre 28 i 50 nm, en una fase expandida que situa la vesícula a 4 nm de la membrana citoplasmàtica.

Puig-Tintó et al. exploren si la transició estructural de la forma compacta a l’expandida segueix una cinètica de primer ordre. Si fos el cas, seguiria una taxa constant de 0,38 ± 0,06 s⁻¹. L’ExHOS començaria com un anell de 19 nm de radi per expandir-se radialment amb una semivida de 3 segons.

Sec18 participa en la dissociació de l’ExHOS estacionari i controla la iniciació de nous esdeveniments exocítics

En llevats als que s’indueix una depleció parcial de Sec18 marcada al domini FRB, hi ha una acumulació de mNG-Sec9 en els clústers, que augmenten la semivida en un factor de 2,5. Això comporta que el 94% ± 4% dels ExHOS d’aquestes cèl·lules siguin expandits, amb un radi de 38 ± 1 nm. Sec18, doncs, és requerida per a la desagregació de l’ExHOS.

Mitjançant la tècnica PICT és possible seguir en cèl·lules vives les interaccions proteïna-proteïna. En llevats que expressen Sec15-FRB i Sec18-mNG, s’evidencia que Sec18 interactua directament amb l’exocist.

L’espectrometria de masses acoblades a purificació per afinitat (AP-MS) indica que Exo84-GFP interactua amb totes les subunitats de l’exocist, i també amb Sec18.

Sec18 permetria, doncs, el reciclatge d’exocists per tal que puguin formar ExHOS en noves vesícules.

La ultraestructura de l’ancoratge i de la fusió

La microscòpia crio-electrònica (crio-CLEM) permet Puig-Tintó et al. de resoldre la ultraestructura de les membranes implicades en l’exocitosi constitutiva. Ho fan en llevats que expressen Sec5, Exo70 i Exo84 fusionades amb mNG.

A través de 95 clústers d’exocists-mNG retratats en tomogrames, Puig-Tintó et al. troben 76 casos amb correlació entre la presència d’una vesícula aïllada i el clúster.

En llevats que expressen Sec9 fusionada amb mScarlet3 (mSc3-Sec9) la crio-CLEM indica correlació entre vesícules aïllades i l’exocist. Aquestes vesícules es troben a menys de 7 nm de la membrana citoplasmàtica.

Les vesícules ancorades s’acumularien en tres estats metastables:
- MS1, amb un 15% de vesícules, se situaria a 27 ± 1,4 nm de la membrana citoplasmàtica.
- MS2, amb un 42% de vesícules, se situaria a 18 ± 2,8 nm de la membrana.
- MS3, amb un 38% de vesícules, se situaria a 5 ± 2,7 nm de distància.

Les vesícules durant l’ancoratge s’acostarien a la membrana citoplasmàtica en tres salts:
- el primer salt seria el més ràpid, i situaria la vesícula fins a 43 nm de la membrana citoplasmàtica, corresponent a l’estat MS1.
- el segon salt seria una aproximació més petita, corresponent a la transició de MS1 a MS2.
- el tercer salt seria el pas de MS2 a MS3. Al cap 7,5 segons de l’inici de l’ancoratge es produiria la fusió de la vesícula amb la membrana citoplasmàtica.

Un model de l’estructura i funcionament de l’ExHOS

L’ancoratge començaria en el moment que un clúster de 7 ± 1 exocists es disposa en un ExHOS de forma anular en un radi de 19 nm. Segueix una expansió radial de l’ExHOS que empeny ràpidament la vesícula cap a l’estat MS1 (a 27 nm de la membrana citoplasmàtica). Quan l’ExHOS arriba a 33 nm de radi, la vesícula passa a l’estat MS2 durant 2 segons. El pas a MS3 és propiciat per l’entrada de Sec9. Arribada la fusió de la vesícula, després d’un període de 1,9 segons comença la desagregació de l’ExHOS per la Sec18.

Esquema de la dinàmica estructural de l’ExHOS en l’exocitosi constitutiva del llevat

Lligams:

- Continuum architecture dynamics of vesicle tethering in exocytosis Marta Puig-Tintó, Sebastian Ortiz, Sasha Meek, Raffaele Coray, Altair C. Hernández, Anna Castellet, Eric Kramer, Laura I. Betancur, Philipp Hoess, Markus Mund, Mercè Izquierdo-Serra, Baldo Oliva, Alex de Marco, Jonas Ries, Daniel Castaño-Díez, Carlo Manzo, Oriol Gallego. Cell (2026).

- Descobreixen el nanomissatger que manté les cèl·lules en funcionament, notícia a la pàgina web de la Universitat Pompeu Fabra.

DROP-AD: marcadors d’Alzheimer en una gota de sang

Neuroquímica: El coneixement de la patologia molecular de la malaltia d’Alzheimer ha permès definir una sèrie de marcadors diagnòstics accessibles per neuroimatge o per anàlisi del fluid cerebroespinal (=líquid cefalorraquidi). Potencialment també es poden rastrejar marcadors d’Alzheimer en mostres de sang venosa de molt bona precisió. Una punció venosa per extraure sang és un mètode molt menys invasiu que la punció lumbar per extraure fluid cerebroespinal o, fins i tot, que l’exploració per neuroimatge. Ara bé, el processament i conservació requerit d’aquestes mostres de sang és molt exigent, la qual cosa limita el seu ús no tan sols en un entorn clínic sinó fins i tot en recerca. El projecte DROP-AD vol facilitar aquesta aplicació mitjançant la detecció de marcadors d’Alzheimer en taques de plasma assecat (DPS) o en taques de sang assecada (DBS). Aquestes taques s’obtenen a partir de sang capil·lar, que s’apliquen directament (DBS) o després d’una centrifugació (DPS). La conservació de les taques és més senzilla per detectar-hi després marcadors com la proteïna tau fosforilada en l’aminoàcid 217 (p-tau217), la proteïna acídica fibril·lar glial (GFAP) o el neurofilament lleuger (NfL). Huber et al., en un article a Nature Medicine publicat ahir, han aplicat el DROP-AD en un estudi amb 337 participants de 7 centres, dels quals 304 participants aportaren mostres de sang capil·lar (DPS o DBS) o de plasma de sang venosa. Huber et al. troben una bona correlació entre els nivells de p-tau217 de DPS i de plasma venós. Els valors de p-tau217 en DPS augmenten en relació a la severitat de la malaltia d’Alzheimer. També són un bon predictor de la positivitat del biomarcador en fluid cerebroespinal. També hi ha bona correlació en la detecció de GFAP i NfL en DBS i DPS. En persones amb síndrome de Down (trisomia del cromosoma 21) els valors d’aquests biomarcadors en sang capil·lar són més elevats en aquells que tenen demència respecte dels que no tenen aquests símptomes. Huber et al. també constaten una alta concordança entre els valors obtinguts en mostres recollides sota supervisió i mostres recollides pel propi participant. Això convida a pensar en DROP-AD com una eina de test d’Alzheimer en contextos de recerca. Els autors, però, consideren que caldrà encara refinar la metodologia de presa de mostres i anàlisi per poder utilitzar DROP-AD en anàlisi clínica.

Huber et al. han assajat en 337 pacients de 7 centres el potencial de DROP-AD en un entorn de recerca per detectar aquesta malaltia a partir d’una gota de sang.

L’anàlisi sang en el diagnòstic de la malaltia d’Alzheimer

En els darrers anys hom ha desenvolupat l’ús de biomarcadors sanguinis per la identificació de la patologia de la malaltia d’Alzheimer. Així doncs, hom ja els ha inclòs en els criteris diagnòstics en recerques epidemiològiques i, cada vegada més, en la mateixa pràctica clínica.

La malaltia d’Alzheimer és un tipus de demència incurable, degenerativa i terminal que, a nivell molecular, ha estat descrita com una proteïnopatia neurològica per acumulació de plaques beta-amiloides i cabdells neurofibril·lars en el cervell. Entre les proteïnes implicades hi ha la proteïna tau. La forma fosforilada de la proteïna tau en el residu 217 (p-tau217) és un dels biomarcadors d’Alzheimer en sang perifèrica. La p-tau217 es pot detectar en sang per mètodes immunològics o per tècniques d’espectrometria de masses. Alguns dels mètodes de detecció de p-tau217 en sang ja han estat aprovats clínicament per a usos diagnòstics. Aquestes anàlisis de sang són especialment útils (per raó de temps i de costos) per a identificar individus que poden beneficiar-se de tractaments emergents o experimentals i/o per fer un seguiment de la progressió de la malaltia.

En un futur proper, l’anàlisi de p-tau217 en sang perifèric podria ajudar a avaluar el risc d’amiloidosi cerebral, i a fer que els pacients amb un risc molt alt o amb un risc molt baix no haguessin de sotmetre’s ni a la tomografia d’emissió de positrons ni a una punció per a extraure líquid cerebroespinal.

Un altre marcador en sang de la malaltia d’Alzheimer és GFAP. Aquesta proteïna és un marcador d’astrogliosi, i es relacionaria amb l’inici de la deposició de plaques beta-amiloides.

Encara un altre marcador és el neurofilament lleuger (NfL). És un marcador de degeneració axonal, procés comú a la malaltia d’Alzheimer i a altres malalties neurodegeneratives.

Les guies clíniques actuals ja recomanen l’anàlisi de biomarcadors d’Alzheimer en sang per a persones que tenen símptomes de demència. En contextos de recerca epidemiològica o en medicina preventiva podria ser interessant aplicar aquests tests en gent gran sense alteracions cognitives, o en persones amb síndrome de Down. És per això que recentment s’ha desenvolupat una plataforma automatitzada d’immunoassaig per a marcadors sanguinis d’Alzheimer. L’immunoassaig automatitzat redueix costos respecte la immunoprecipitació acoblada a l’espectrometria de masses. Ara bé, tant en un cas com en l’altre cal seguir un protocol precís en l’extracció i emmagatzematge de mostres de sang venosa.

El projecte DROP-AD nasqué pensant en aquesta darrera limitació. La recol·lecció de sang capil·lar sobre cartes, tant si es tracta de dipositar-hi una gota de sang (DBS) com de dipositar-hi una gota de plasma (DPS, és a dir del sobrenedant ulterior a la centrifugació de la sang), és molt més senzilla que la venopunció. La DBS o DPS es poden conservar a temperatura ambient, mentre que la sang obtinguda per venopunció s’ha de centrifugar immediatament i el plasma resultant s’ha de mantindre en fred fins a l’anàlisi. La DBS la pot aconseguir el propi subjecte després de punxar-se en la punta d’un dit.

Huber et al. presenten ara dades de DROP-AD obtingudes en set centres diferents d’Europa sobre 337 participants. Les mostres eren sang capil·lar obtingudes per punxades en dit. Els biomarcadors analitzats eren p-tau217, NfL i GFAP. Com a referents empraven les dades de biomarcadors aconseguides dels mateixos participants en sang venosa i en fluid cerebroespinal.

Set centres participants

En aquest estudi han participat set centres europeus. La recol·lecció de la sang capil·lar la feia personal format de cada centre. Les cartes amb la sang seca eren trameses sense control de temperatura al Laboratori de Neuroquímica de la Universitat de Goteborg. Les mostres de plasma de sang venosa eren guardades en ultracongelació (−80 °C) i eventualment trameses a Goteborg en paquets amb gel sec.

Els participants de l’estudi van aportar consentiment informat per escrit abans de l’enrolament. L’estudi fou aprovat per comitès ètics locals.

La cohort de Barcelona és la de Ace Alzheimer Center. Incloïa persones que reportaven problemes cognitius que foren recrutades entre setembre del 2022 i abril del 2024. La Fundació ACE feia el diagnòstic clínic amb una avaluació neuropsicològica (NBACE). A les persones amb MCI o demència se’ls oferia la realització d’una punció lumbar. Les mostres de sang o de CSF es prenien el mateix dia en dejuni. L’aprovació de l’estudi fou a càrrec dels Comitès Ètics de l’Hospital Universitari de Bellvitge.

La cohort de Goteborg és la de H70 Clinical Studies. Els participants eren recrutats a la clínica de la memòria de l’Hospital Universitari Sahlgrenska entre juny del 2023 i abril del 2024 en persones amb símptomes cognitius.

La cohort de Malmö és formada pels assaigs clínics BioFINDER Primary Care i BioFINDER Preclinical AD, en participants enrolats entre desembre del 2023 i novembre del 2024.

La cohort de Brescia és formada pel Centre de Malalties Neurodegeneratives de la Universitat de Brescia. Es tracta de pacients amb demència i de controls formats per familiars.

La cohort d’Exeter és formada per la University of Exeter Medical School, amb adults majors de 50 anys amb un índex de massa corporal superior a 25 en el marc del PROTECT-UK de suplementació amb polifenols. És en aquesta cohort on als pacients se’ls oferia la possibilitat de fer-se una segona extracció de sang capil·lar per ells mateixos sense supervisió.

La cohort de Copenhague és formada a la clínica de memòria del Rigshospitalet.

La cohort del Sant Pau era formada amb persones amb síndrome de Down recrutades a la Unitat de Memòria de l’Hospital de Sant Pau en el marca del DABNI (Down Alzheimer Barcelona Neuroimaging Initiative).

La sang capil·lar era dipositada en les cartes Capitainer SEP-10 (Capitainer AB), Capitainer B50 (Capitainer AB) i Telimmune Plasma Separation Card (Novilytic).

Els 337 participants tenien una edat mitjana de 70,8±11,7 anys. El 53,4% (167) eren dones.

Els valors de p-tau217 en plasma sec de sang capil·lar i en plasma de sang venosa

De 252 participants (d’edat de 72,7±9 anys, i 56,7% dones), hi havia dades de mostres de plasma de sang capil·lar seca (DPS) i de plasma de sang venosa. La correlació de rang de Spearman era de 0,74, amb un interval de confiança del 95% de 0,678-0,791.

La correlació era particularment alta en la cohort de Goteborg (0,904) i en la de Brescia (0,838). En canvi, era força més baixa en la de Malmö (0,429), l’únic centre on empraven un assaig diferent per al plasma venós. La cohort de Barcelona (que amb 133 participants és la més grossa) tenia una valor de correlació intermedi.

En estratificar les concentracions plasmàtiques de p-tau217 en tercils, Huber et al. troben correlacions en els dos tercils superiors, però no pas en el tercil inferior. Val a dir que en aquest tercil inferior tots els participants havien donat negatiu en la detecció de Aβ42/p-tau181 en fluid cerebroespinal.

L’edat i el sexe no afectaven la correlació entre els valors venosos i capil·lars de p-tau181.

Per a 209 participants s’investigà la relació entre DPS p-tau217 i l’escala MMSE (Mini Mental State Evaluation): la correlació és negativa (-0,374). La correlació entre la p-tau217 venosa i l’escala MMSE era similar (-0,410)

Per a 249 participants s’investigà la relació entre DPS p-tau217 i l’edat: la correlació era positiva (0,334). La correlació entre la p-tau217 venosa i l’edat era semblant (0,317).

La precisió diagnòstica de p-tau217 en sang capil·lar seca

Els valors de DPS p-tau217 eren significativament superiors en persones diagnosticades amb alteració cognitiva lleu (MCI) o amb malaltia d’Alzheimer (AD) respecte de les persones sense alteració cognitiva (CU) o amb demències no-AD.

Els valors de DPS p-tau217 també eren superiors en el grup de participants amb biomarcadors Aβ42/p-tau181 en fluid cerebroespinal (CSF).

Per a 176 participants es disposaven de dades de DPS p-tau217 i de CSF Aβ42/p-tau181. El 56,3% d’aquests participants donaven positiu per a CSF Aβ42/p-tau181. Si considerem positius valors de DPS p-tau217 superiors a 0,01 pg ml⁻¹, el valor predictiu positiu de la tècnica és de 0,738 i el valor predictiu negatiu de 0,833, amb una especificitat del 58,4%.

Els valors de GFAP i NfL en sang capil·lar seca

Per a 240 participants (d’edat de 69,9±10,8 anys; 48,8% dones) hi havia almenys una dada de mètodes de sang capil·lar seca (DBS).

La correlació dels nivells de GFAP en DBS i en sang venosa era forta (0,773). També hi ha correlació entre nivells de GFAP i edat (0,392), i entre nivells de GFAP i MMSE (-0,448).

La correlació dels nivells de NfL en DPS i en sang venosa era forta (0,83). També hi ha correlació entre nivells de NfL i edat (0,429), i entre nivells de NfL i MMSE (-0,269).

p-tau217 i GFAP en persones amb síndrome de Down

Per a 31 participants amb síndrome de Down hi havia dades de biomarcadors. Com passa amb la població euploide, entre ells hi ha una correlació entre els valors de sang capil·lar seca i de sang venosa. Aquests biomarcadors augmenten en els participants amb demència.

L’automostra de sang capil·lar seca

Per a 30 participants hi havia mostres de sang capil·lar seca recollides sota supervisió i mostres recollides pel propi participant sense supervisió. Els valors de biomarcadors p-tau217 i GFAP eren concordants en tots dos casos.

DROP-AD en la recerca i en la clínica

El projecte DROP-AD és especialment adreçat a entorns de recerca. Ofereix una alternativa a l’obtenció de mostres per venopunció, simplificant la recol·lecció de mostres.

La correlació entre les concentracions de p-tau217 en sang capil·lar seca i en sang venosa són fortes, però hi ha variabilitat entre els set centres que han participat en l’estudi. En la sang capil·lar seca els valors dels biomarcadors són inferiors als de la sang venosa, degut probablement a la dilució de mostra de sang capil·lar amb la solució tamponada.

Huber et al. pensen que DROP-AD pot ésser especialment indicada per a persones amb síndrome de Down. Tot i amb tot, no recomanen l’ús en contextos clínics de presa de decisions o de gestió de pacients. Per fer-ho hauran de refinar la metodologia i validar-la.

Lligams:

- A minimally invasive dried blood spot biomarker test for the detection of Alzheimer’s disease pathology. Hanna Huber, Laia Montoliu-Gaya, Wagner S. Brum, Jakub Vávra, Yara Yakoub, Haley Weninger, Luisa Sophie Braun-Wohlfahrt, Joel Simrén, Mercé Boada, Agustín Ruiz, Amanda Cano, Adelina Orellana, Sergi Valero, Laia Cañada, Natalia Tantinya, Ana Belen Nogales, Pilar Sanz-Cartagena, Anna Dittrich, Ingmar Skoog, Millie Sander-Long, Clive Ballard, Megan Richards, Mary O’Leary, Frederikke Kragh Clemmensen, Hannah H. D. Wandall, Daniele Altomare, Valentina Cantoni, Erik Stomrud, Sebastian Palmqvist, Alberto Lleo, Daniel Alcolea, Maria Carmona Iragui, Aida Sanjuan Hernandez, Bessy Benejam, Laura Videla Toro, Alpana Singh, Marisa N. Denkinger, Anja Hviid Simonsen, Silke Kern, Anne Corbett, Juan Fortea, Lee Honigberg, Barbara Borroni, Oskar Hansson, Xavier Morató, Kaj Blennow, Henrik Zetterberg & Nicholas J. Ashton. Nature Medicine (2026).