Tal com llegíem ahir en un document del Comitè Català Assessor Covid-19, per fer front als escenaris potencials de la pandèmia és vital disposar d’eines ràpides de detecció de la infecció per SARS-CoV-2 en persones de risc per tal d’aprofitar al màxim els fàrmacs existents que protegeixen contra la progressió a les formes greus de la malaltia. Rubaiya Hussain, que fa la tesi doctoral en optoelectrònica en el grup de recerca que lidera Valerio Pruneri a l’Institut de Ciències Fotòniques (ICFO), de Castelldefels, és la primera autora d’una comunicació a Biomedical Optics Express que presenta un viròmetre de flux de baix format per al SARS-CoV-2. Les proves de diagnòstic del SARS-CoV-2 es basen fonamentalment en la reacció en cadena de polimerasa prèvia retrotranscripció (RT-PCR) o en la reacció antigen-anticòs. Mentre que la darrera és prou ràpida però no prou sensible, la primera és prou sensible però massa lenta i massa costosa. El lector de virometria de flux (FVR) que presenten Hussain et al. es basa en una nova tecnologia optofluïdica, aplicable a mostres de saliva, i que seria prou ràpida i fiable per a la detecció de SARS-CoV-2. L’aparell constat d’un petit xip microfluïda i d’un cap òptic de bomba de làser: la detecció del virus es fa través d’anticossos marcats amb fluorescència. Hussain et al. estimen que la sensibilitat de l’aparell és del 91,2% i l’especificitat del 90%. El temps requerit per assolir un resultat és inferior a la mitja hora. Les dimensions de l’aparell (25 x 30 x 13 cm), que encara poden minimitzar-se, el poder fer viable en punts d’assistència primària.
Rapidesa i sensibilitat
La recerca ha estat encapçalada per Rubaiya Hussain, Alfredo E. Ongaro i Maria L. Rodriguez de la Concepción. Hussain i Ongaro són membres de l’ICFO, i Rodríguez ho és d’Irsi Caixa, de Badalona. També són de l’ICFO Ewelina Wajs i Valerio Pruneri. Són d’Irsi Caixa Eva Riveira-Muñoz, Ester Ballana, Julià Blanco, Marta Massanella, Eulalia Grau, Bonaventura Clotet i Jorge Carrillo. Del Departament de Malalties Infeccioses de l’Hospital Germans Trias i Pujol de Badalona són, a més de Clotet, Anna Chamorro i Lourdes Mateu.
La recerca s’ha finança a través de projectes del programa Severo Ochoa del Ministeri de Ciència, de l’Agència de Gestió d’Ajuts Universitaris i de Recerca, de la Fundación Cellex, del programa Beatriu de Pinós, del programa Marie Skłodowska-Curie i del programa de Centres de Recerca de Catalunya. També s’han utilitzat fons del projecte “YomeCorono” i la Foundation Dormeur finançà l’adquisició d’un sistema de PCR a temps real de QuantStudio-5.
Pruneri declara que és un dels titulars d’una patent de tinció i processament de mostres per a sistemes d’anàlisis automatitzats de partícules.
“Tests! Tests! Tests”, deia Tedros Adhanom Ghebreyesus fa dos anys davant de l’avenç de la infecció per SARS-CoV-2, en la primera onada de covid-19. Els tests permeten identificar els individus infectats i, amb l’adopció de mesures específiques de distanciament, aturar cadenes de contagi. El diagnòstic de la infecció es basa en la detecció de material víric, bé a traves de proves immunològiques de detecció d’antígens bé a través de proves de detecció d’ARN viral. En entorns clínics, la prova preferida al llarg d’aquests dos anys ha estat la RT-PCR (una ronda de retrotranscripció de l’ARN a ADN, i la replicació de l’ADN amb l’ús de primers específics per al SARS-CoV-2) sobre hisops nasofaringis. La RT-PCR és altament específica i sensible, i s’han fet esforços per reduir-ne costos i temps d’assaig, però hi ha obstacles que romanen: 1) cal una extracció prèvia d’ARN; 2) cal un laboratori especialitzat; 3) cal personal altament preparat. En contextos d’alta incidència no hi ha hagut més remei que recórrer a l’alternativa de testos ràpids d’antígens, que també són més barats. De manera semblant, hom ha optat per mostres de saliva o mostres nasals. Però allò que s’estalvia en costos i temps es perd en sensibilitat.
El biosensors òptics, segons Hussain et al., poden combinar una alta sensibilitat amb la facilitat d’ús, rapidesa i possibilitat d’implantar en l’assistència primària i en farmàcies. Utilitzar mostres de saliva facilita la recol·lecció, que pot fer el mateix pacient.
El dispositiu que presenten Hussain et al. es basa en la citometria de flux, una tècnica ja clàssica d'anàlisi cel·lular basada en tecnologia làser. Els citòmetres de flux, no obstant, foren pensats per a la detecció de cèl·lules i no de virus. Alhora, els citòmetres convencionals són voluminosos (50 cm) i costosos (de 30.000 a 300.000 €). El viròmetre de flux de Hussain et al. integra de manera compacte un xip microfluidic, un cap òptic làser i un comptador multipíxel de fotons (MPPC). El sistema detecta proteïnes S de SARS-CoV-2 marcades amb fluorescència, i ha estat validat amb un test cec amb 54 mostres clíniques.
Disseny, calibratge i validació
Les parts optomecàniques del FVR foren adquirides de Thorlabs. El MPPC fou comprat a Hamamatsu Photonics. El xip microfluïdic a Dolomite Microfluidics. La bomba fou adquirida a CETONI GmbH. Per gravar el senyal de MPPC s’utilitza un oscil·loscopi USB de PicoScope. S’utilitzà un codi MATLAB per comptar el nombre de deteccions, fixant un valor llindar de 3,5 mV. Les mostres eren diluïdes en un tampó salí fosfat (PBS).
Un cop muntat, el sistema FVR fou calibrat amb boles de poliestirè fluorescent de 2 μm de mida a una concentració de 250 boles/ml. Aquestes boles (“Dragon Green” de Bangs Laboratories, Inc.) tenen un pic d’emissió de 520 nm quan són excitades a 480 nm. El flux de la solució fou fixat a 1 ml/minut. La posició del xip fou ajustada fins aconseguir que detectés 2 esdeveniments per segon.
Les mostres de saliva de casos confirmats de covid-19 utilitzades (un total de 34) provenien de Can Ruti. Foren recollides en el marc de la segona onada de covi-19 (entre el juliol i l’octubre del 2020). Les mostres control provenien d’un donant no-infectat. El criteri de diagnòstic, en els 35 casos, era una prova de RT-qPCR. L’estudi havia rebut l’aprovació del Comitè corresponent de Can Ruti, en el marc de l’extensió de la cohort KING, i comptà amb el consentiment informat de tots els participants. Les mostres eren inactivades per valor (1 hora a 56 °C), per bé que l’experiment fou igualment conduït en un laboratori amb nivell 2 de bioseguretat.
Les mostres eren diluïdes 1:100 en PBS i filtrades a través d’un sistema Corning de 0,20 μm. Eren immunomarcades amb l’anticòs policlonal Alexa 488-anti-S-SARS-CoV, diluït a una concentració de 100 ng/mL. El fluorocrom Alexa 488 té un pic d’excitació a 490 nm, amb pic d’emissió a 520 nm. Cada 500 μl de saliva filtrada eren exposats a 500 μl d’anticòs diluït. Les mostres eren incubades a temperatura ambient durant 20 minuts, i després se les mesurava per FVR. El temps de lectura era de 160 segons. Totes les mostres foren mesurades per triplicat. El rentat entre mostra i mostra es feia amb cicles de circulació de 2 ml de PBS fins que el senyal de fluorescència tornava a un valor de zero. De mitjana, la neteja s’assolia amb sis d’aquests cicles.
Com a control positiu s’emprava proteïna recombinant S de SARS-CoV-2, adquirida a SinoBiological.
L’optimització de l’assaig
La concentració òptima d’anticossos fou determinada experimentalment a través d’una sèrie de solucions decimals de salives de donants infectats en salives de donants no-infectats (des de 107 còpies genòmiques de SARS-CoV-2/mL fins a 100 còpies/mL) combinada amb quatre concentracions diferents d’anticòs (de 50 ng/ml a 25 μg/ml). Així es determinà que la concentració de 50 ng/ml d’anticossos era la més efectiva.
El temps d’incubació fou també determinat experimentalment. Es provaren cinc punts (de 5 minuts a 50 minuts). El senyal augmentava a partir dels 15 minuts d’incubació i arribava a un plató a 20 minuts.
Experiments següents determinaren el límit de blanc (LOB) i el límit de detecció (LOD), i construïren un corba patró entre el senyal FVR i la càrrega viral. S’investigà la reproductibilitat del senyal FVR en tota el rang lineal. El LOD fou mesurat en 3834 còpies/mL, que és un valor tres ordres de magnitud inferior a la dels tests ràpids d’antígens comercials. El rang analític va de 4000 a 10.000.000 de còpies genòmiques/mL.
Un test cec amb 54 mostres de saliva
El test cec per avaluar l’especificitat i sensibilitat de l’equip es va fer amb 54 mostres congelades de saliva, 34 de persones infectades per SARS-CoV-2 i 20 de persones no-infectades. La càrrega viral d’aquestes mostres fou determinada paral·lelament amb RT-qPCR.
De les 34 mostres positives per RT-qPCR, 31 van donar positiu per FVR. De les 20 mostres negatives per RT-qPCR, 18 van donar negatiu per FVR. Així doncs, 3 mostres positives de 34 van donar un “fals negatiu” i 2 mostres negatives de 20 van donar un “fals positiu”. Això es correspon a una sensibilitat diagnòstica del 91,2% i a una especificat diagnòstica del 90%.
La tècnica de FVR permet una estimació quantitativa de la càrrega viral.
Hussain et al. pensen que l’especificitat de l’assaig es podria millorar amb l’ús d’anticossos monoclonals. En tot cas, consideren que l’FVR és prou ràpid, fiable i barat. Calculen que el seu sistema podria ser capaç de realitzar uns 2000 tests diaris. Aquesta xifra podria augmentar si en la mateixa unitat es fessin diverses reaccions simultànies. El cost de materials per construir l’equip és d’uns 10.000 €, però Hussain et al. pensen que això es reduiria si es passés a una producció a gran escala.
La recol·lecció de mostres es podria fer a través d’un kit d’autocol·lecció, que inclogués un tub amb els reactius i amb un filtre que clarifiqués la saliva. Cada test podria tenir un cost operatiu d’uns 2 €.
N’hi hauria prou amb canviar la solució d’anticossos, perquè el sistema fos capaç de detectar variants específiques de SARS-CoV-2, o d’altres coronavirus estacionals, o d’altres virus. Alhora el sistema també podria adaptar-se per a la detecció d’anticossos en mostres clíniques, cosa que abaratiria els actuals estudis seroepidemiològics o que obriria la porta a fer un diagnòstic del nivell de protecció contra tal o tal virus que té una persona. És clar que cadascuna d’aquestes adaptacions requeriria noves rondes de validació.
Lligams:
- Small form factor flow virometer for SARS-CoV-2. Rubaiya Hussain, Alfredo E. Ongaro, Maria L. Rodriguez de la Concepción, Ewelina Wajs, Eva Riveira-Muñoz, Ester Ballana, Julià Blanco, Ruth Toledo, Anna Chamorro, Marta Massanella, Lourdes Mateu, Eulalia Grau, Bonaventura Clotet, Jorge Carrillo, and Valerio Pruneri. Biomedical Optics Express 13: 1609-1619 (2022).
Cap comentari:
Publica un comentari a l'entrada